红树土壤浸出液对海洋微藻的影响研究

.序言1.1研究意义及背景红树林作为生长在热带和亚热带地区的主要滨海植被，与生态文明建设息息相关，提供着重要的生态系统和保护服务功能，具有高生产力、高分解率、高归还率的特征，大量污染物通过多种路径最终聚集到红树林，加上红树林的独特环境因子，会从而加速了重金属在红树林生态系统内的富集REF_Ref9724\w[1]。海洋生态系统中的重金属的来源主要有三种途径：大气沉降、陆源输入和天然源，并且陆源输入是最常见的REF_Ref17907\w[3]REF_Ref17910\w[4]。但是目前的污水处理并不能有地彻底清除有害物质，长期的暴漏污染可能会对海洋生态系统造成不容忽视的威胁REF_Ref132669788\w[2]。海洋微藻是原始植物，是地球上最古老的生命之一，细胞内具有叶绿素可以进行光合作用产生氧气，并且占全球氧气的七成，在生态系统中是最重要的氧气来源，同时在海洋生态系统中作为初级生产力的基础，在物质循环以及能量流动环节中起着不可替代的作用REF_Ref19295\w[5]REF_Ref19311\w[6]，海洋微藻群落的动态变化对海洋生态系统的平衡和稳定具有重要意义。目前，红树林土壤浸出液对海洋微藻影响的相关研究相对较少，本研究探索红树林土壤浸出液对海洋微藻的影响作用，研究结果有利于对海洋微藻的保护提供有价值的数据。1.2国内外研究进展1.2.1红树林的重要性红树林生长在热带、亚热带潮间带特殊的植被类型，受到周期性潮水的湿地木本生物群落REF_Ref18671\w[7]，具有丰富的物种多样性，蕴含着大量丰富的生物资源，也为许多生物提供营养物质和生存场所REF_Ref18671\w[7]REF_Ref20392\w[8]。在海洋生态系统中，红树林作为重要的生态系统起着至关重要的作用，包括维持沿岸环境的稳定、保护海岸线免受海浪侵蚀、提供栖息地和食物来源等，是海洋生态系统不可或缺的一部分REF_Ref4713\w[9]。由于红树林所处的地理位置，使得红树林的生态环境受到海洋以及陆地的双重影响，由于社会的快速发展以及人类的活动加剧导致红树林土壤受到污染，并且污染物成分复杂,致使其环境压力日益增加，尤其注意的是重金属。因为重金属具有毒性、隐蔽性和持久性，可能会对红树林湿地系统造成潜在风险，而那些还会进入海洋生态系统，长期累积会导致海洋生态系统中的一些生物遭受到危害REF_Ref5569\w[10]REF_Ref5572\w[11]。但对于良好的红树林生态系统，土壤中一些重金属在低浓度是会促进海洋生物的生长。1.2.2红树林土壤浸出液对藻类的影响红树淡水土壤浸出液是红树林地区土壤中被降雨或灌溉水冲洗出来的液体，它含有丰富的有机物质和无机盐。研究发现，红树淡水土壤浸出液中含有大量的有机酸、重金属以及无机盐物质，这些有机物质和无机盐的丰富组成为红树淡水土壤浸出液的特性特点之一。其中有机酸是红树土壤浸出液的重要组成部分，其中包括乙酸、丁酸、柠檬酸等多种有机酸。这些有机酸对海洋生态系统的影响很大，它们可以降低水体的pH值，影响海水中溶解氧的浓度，进而影响海洋藻类的生长和繁殖。有机酸还可以作为海洋生物的营养物质，促进海洋生物的生长发育。重金属也是红树土壤浸出液的组成部分，Cd和Zn是两种常见的重金属元素，它们在红树淡水土壤浸出物中的浓度可能对海洋小球藻产生不同程度的影响。研究表明，Cd和Zn的高浓度会对海洋小球藻的生长和代谢产生负面影响导致海洋生态系统稳定遭到破坏REF_Ref16387\w[15]，但同时在较低且适宜的浓度下重金属又是一些海洋生长必不可少的元素。总的来说，红树淡水土壤浸出液的组成成分丰富多样，它对海洋生态系统的影响既有积极的一面，又有负面的一面。因此，研究红树淡水土壤浸出液对海洋生态系统的影响，有助于我们更好地理解海洋生态系统的运行机制，为海洋环境保护与管理提供科学依据REF_Ref14565\w[12]。1.2.3海洋小球藻的重要性海洋小球藻（Chlorellasp.）是一种单细胞藻，属于绿藻门绿藻纲绿球藻目小球藻科REF_Ref15111\w[13]，海洋小球藻中富含多种营养成分包括维生素、蛋白质、类胡萝卜素等。根据研究显示，海洋小球藻是一种理想的蛋白质资源REF_Ref15137\w[14]。海洋小球藻还可以吸收大气中的二氧化碳，有助于减缓气候变化的发展，不仅如此，小球藻还能减少水体中的氮和磷等营养盐，减少水体富营养化的程度，保护海洋生态系统的平衡，在海洋生态系统中也扮演着重要的地球系统调节角色。海洋小球藻的细胞虽然结构简单，但它的功能具有多样性。它们具有高度的生物多样性，既可以单独生长，也可以形成大规模的海洋小球藻藻华。海洋小球藻在藻华中具有协同作用，通过共同生存和合作，提高了其在海洋生态系统中的适应能力。总的来说，海洋小球藻在海洋浮游植物中比例较大，对海洋生态系统的稳定有着重要的作用。深入研究海洋小球藻的生态习性、分布情况和生物学特征，有助于更好地保护海洋生态环境，维护全球生态平衡1.3研究内容及技术路线1.3.1研究内容（1）选择不同地区具有代表性的红树林区域开展研究：海南省儋州市春马大桥红树林保护区、海南省三亚市青梅港红树林保护区。（2）探究不同地区红树林土壤浸出液的差异：通过盐度、pH值、Zn、Cd等指标来判断不同地区土壤浸出液的特征，并探讨深度的影响。（3）探究红树土壤浸出液对海洋小球藻的影响，通过测定藻液OD680判断土壤浸出液对海洋小球藻生长状况的影响。1.3.2技术路线2实验材料与仪器2.1红树林土壤红树林土壤取自海南省儋州市春马大桥红树林保护区、海南省三亚市青梅港红树林保护区2.2实验试剂表1材料与试剂试剂名称生产商盐酸（分析纯）阿拉丁生化科技公司锌Zn单元素标准溶液国家有色金属及电子材料分析测试中心镉Cd单元素标准溶液国家有色金属及电子材料分析测试中心2.3培养基表2海水培养基（F/2培养基）营养盐化学药品母液含量氮NaNO375g/L磷NaH2PO4·2H2O5.62g/L硅NaSi2O3·9H2O30g/L微量1Na2EDTA4.36g/LFeCl3·6H2O3.15g/L微量2CuSO4·5H2O0.0098g/LZnSO4·7H2O0.022g/LCoCl2·6H2O0.01g/LMnCl2·4H2O0.18g/L维生素1VitaminB10.1g/L维生素2VitaminB120.0005g/LVitaminH0.0005g/L2.4实验器材与仪器实验器材：三角烧瓶、封口膜、橡皮筋、玻璃棒、称量纸、一次性过滤膜、针管、移液枪、离心管。表3设备与仪器仪器名称型号厂家智能人工气候箱HP250GS武汉瑞华仪器设备有限公司电子天平PX223ZH/E奥豪斯（常州）有限公司紫外可见分光光度计T6新世纪北京谱析通用仪器有限公司光学显微镜CX21FXS1奥林巴斯（中国）有限公司离心机TDZ5湘仪实验室仪器有限公司高压蒸汽灭菌锅GR85DA致微（厦门）仪器有限公司盐度计LS10T广州市速为电子科技有限公司-20℃冰箱BCD-192MT康佳集团股份有限原子吸收光谱仪NovAA350德国耶拿分析仪器股份公司隔膜真空泵GM-0.33Ⅱ天津市津腾实验有限公司3实验步骤3.1红树土壤采集与浸出液制备分别于2023年7月25日和7月26日在海南省儋州市春马大桥和海南省三亚市青梅港红树林保护区选取合适的地点，用采样器采集两个地区四个深度的土样（分别为0~5cm、5~10cm、10~15cm、15~20cm），分别装在洁净的自封袋中，同一地区四种深度的土样放在一个大的自封袋中，在袋子上作好记录，带回实验室后，进行零下20°冷冻处理。取冷冻的土样首先解冻成常温状态下的土壤，用电热恒温鼓风干燥箱烘干后进行研磨过筛，用去离子水作为溶剂，取每种土样100g分别置于三角瓶内，加无菌水300mL，在25℃下144r/min振荡24h，静置48h，首先用滤纸进行初步过滤，然后在超净工作台内经0.22μm的滤膜过滤于三角烧瓶中。在三角烧瓶上标记好土壤来源，观察每组土壤颜色、浑浊度等的不同，做好记录。3.2土壤浸出液pH值、盐度pH测定：取制备好的土壤浸出液加入15mL离心管中，利用电子pH计测定样品pH值，每个样品重复测量3次，求取平均值作为最终pH值。盐度测定：每种样品取5mL使用盐度计测量红树林土壤浸出液的盐度，每个样品重复测量3次，求取平均值作为最终盐度。3.3土壤浸出液重金属Zn以及Cd的测定首先配置Zn以及Cd的校正标准溶液。Zn的校正标准溶液：用1000μg/mL的Zn标准样品稀释成1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL的校正标准溶液，首先计算出配置最高浓度的校正标准液，需要取250μL标准样品于50mL容量瓶中，加入1mL盐酸，最后用去离子水定容至容量瓶刻度线处。再逐级稀释配置较低浓度的校正标准溶液。Cd的校正标准溶液：用1000μg/mL的Cd标准样品稀释成0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL的校正标准溶液，首先计算出配置最高浓度的校正标准液需要50μL标准样品于50mL容量瓶中，加入1mL盐酸，用去离子水定容至刻度线。再逐级稀释配置较低浓度的校正标准溶液。（1）然后用原子光谱吸收仪进行土壤浸出液的测定，原子光谱吸收仪的使用方法如下：在使用原子吸收光谱仪前，需要进行仪器的预热和波长调整。预热时间一般为30分钟至1小时，以保证仪器达到稳定的工作状态。（2）波长调整到Zn以及Cd的特定波长，以保证测定的准确性。（3）在测定过程中，将土壤浸出液注入原子吸收光谱仪的样品室中，通过雾化器将样品转化为气溶胶状态，然后在火焰或石墨炉中原子化。（4）当特定波长的光通过原子化后的样品时，样品中的重金属原子会吸收光能，进而产生吸收光谱。（5）通过测量吸收光谱的强度，可以得出样品中重金属Cd和Zn的含量。（6）根据吸光度和浓度的关系，可以得出校正标准曲线，用土壤浸出液的吸光度与校正标准曲线进行比较后得出样品中Zn和Cd的浓度。3.4海洋小球藻的培养本实验选用海洋小球藻藻由上海光语生物科技有限公司提供。实验所使用的海水通过0.25μm滤膜过滤并灭菌后待用，在灭过菌的海水中按比例加入配置F/2培养基所需要的物质，在超净工作台中将海洋小球藻接种到已经灭过菌的三角烧瓶中REF_Ref17184\w[16]，将恒温培养箱温度设置为25℃，明暗周期为12h：12h，光照强度为6000lx，将海洋小球藻放置培养箱中培养。培养至藻液生长对数期后重复上述步骤继续培养，反复接种传代3~5次后，在显微镜下观察直至没有其他杂质后留样进行后续实验。在培养藻液时，为了防止微藻黏附到瓶壁上，需要每天摇晃培养瓶。3.4.1藻细胞计数充分摇匀海洋小球藻藻藻液，用计数框为16×25的血球计数板在400×400显微镜下计数．每个样品计数两次，两次误差在15%以上重复计数，求四次的平均数，将藻液稀释为1×10^6cells/mL的藻液，进行下一步实验的进行。3.5土壤浸出液对海洋小球藻生长的影响实验3.5.1土壤浸出液对海洋小球藻的培养为了研究红树土壤浸出液对海洋小球藻生长的影响，设计实验组和对照组。在超净工作台中进行操作，实验组加入红树土壤浸出液75ml、藻液75ml于三角烧瓶中，对照组则加入等量的已经灭菌的海水75ml，同样的藻液75ml于三角烧瓶中，共8组实验组和1组对照组，每组设置三个平行样，以减小实验误差，放置在恒温培养箱中培养，等到第五天停止培养，对藻液进行Zn、Cd含量的测定以及测量藻液吸光度。3.5.2土壤浸出液培养小球藻的重金属测定在超净工作台中，取对照组和实验组每个平行样藻液各10mL于离心管中，5000rpm，离心15min，取上清液进行用原子光谱吸收仪进行土壤浸出液的测定，配置Zn、Cd的校正标准液的方法以及原子光谱吸收仪的使用方法同上。3.5.3土壤浸出液培养小球藻的吸光度测定使用紫外可见分光度计和比色皿（光径为1.0cm）测定藻液光密度OD680值来观察藻液生长率。首先将每组藻液混匀后静置几分钟，让死亡的小球藻沉到三角烧瓶底部，用移液枪取中部的藻液至比色皿中加满，使用紫外可见分光度计测量在680nm处藻液的吸光度，做好记录。3.6数据处理与分析实验结束后，我们收集并整理了所有实验数据，包括OD680值、pH值、盐度、重金属Zn和Cd的含量等。为了更直观地了解红树土壤浸出液对海洋小球藻生长的影响，我们利用Excel和Oringin等软件对数据进行了处理和分析。实验结果与分析4.1土壤浸出液的分析4.1.1土壤浸出液的颜色图1春马大桥土壤浸出液颜色依次为0-5cm、5-10cm、10-15cm、15-20cm深度）图1春马大桥土壤浸出液颜色依次为0-5cm、5-10cm、10-15cm、15-20cm深度） 图2青梅港土壤浸出液颜色依次为0-5cm、5-10cm、10-15cm、15-20cm深度）图2青梅港土壤浸出液颜色依次为0-5cm、5-10cm、10-15cm、15-20cm深度）制备土壤浸出液得到图1和图2,观察图1和图2土壤浸出液的颜色存在一定的差异，由图可以得出随着土壤深度的增加，土壤浸出液的透明度增加，土壤浸出液的颜色逐渐变浅，春马大桥以及青梅港两个地区均呈现这个规律。4.1.2土壤浸出液的盐度图4青梅港红树林土壤浸出液的盐度值图3春马大桥红树林土壤浸出液的盐度值图4青梅港红树林土壤浸出液的盐度值图3春马大桥红树林土壤浸出液的盐度值值将制备好的土壤浸出液进行盐度测定，得到图3和图4，对比分析得到在同一地区的红树林土壤在0-20cm的深度中，土壤深度越深，浸出液的盐度较高，不同地区间的土壤的盐度存在差异。4.1.3土壤浸出液的pH值图5土壤浸出液的pH值图5土壤浸出液的pH值用pH计测得两个地区的pH值如图5所示，春马大桥以及青梅港红树林土壤浸出液不同深度的pH值，两个地区土壤的pH值较为接近，且在0-20cm深度中pH值变化很小。4.1.4土壤浸出液中重金属的含量图6春马大桥红树林土壤浸出液Zn含量图7青梅港红树林土壤浸出液Zn含量图6春马大桥红树林土壤浸出液Zn含量图7青梅港红树林土壤浸出液Zn含量图8春马大桥红树林土壤浸出液Cd含量图9青梅港红树林土壤浸出液Cd含量图8春马大桥红树林土壤浸出液Cd含量图9青梅港红树林土壤浸出液Cd含量根据图6-9，得出两个地区土壤浸出液中重金属Zn的含量均高于Cd的含量。春马大桥红树林不同深度的土壤浸出液中Zn以及Cd的含量差别不大，无明显规律，青梅港红树林不同深度的土壤浸出液中Zn以及Cd的含量有细微差别，其中Zn含量最高的深度为5-10cm，Cd的含量随深度增加而增加。4.2土壤浸出液对海洋小球藻生长的影响4.2.1培养小球藻之后土壤浸出液的重金属含量图10春马大桥红树林图10春马大桥红树林图11青梅港红树林培养小球藻后土壤浸出液Zn含量培养小球藻后土壤浸出液Zn含量图12春马大桥红树林图13青梅港红树林图12春马大桥红树林图13青梅港红树林培养小球藻后土壤浸出液Cd含量培养小球藻后土壤浸出液Cd含量根据图10-13与图6-9的Zn以及Cd含量对比可知两者数值均降低，表明小球藻生长过程中会吸收Zn以及Cd，且两个地区土壤浸出液培养的小球藻吸收Zn、Cd的规律有所不同，青梅港地区土壤深度越深小球藻所吸收的Zn和Cd越少，春马大桥地区0-15cm的Zn吸收呈现此规律，总体上看春马大桥地区15-20cm处的土壤浸出液培养小球藻对这两种金属的吸收规律与0-15cm深度的对比较为特殊。4.2.2小球藻吸附的金属含量图14春马大桥红树林图15青梅港红树林图14春马大桥红树林图15青梅港红树林小球藻生长吸附Zn的含量小球藻生长吸附Zn的含量图16春马大桥红树林图17青梅港红树林小球藻生长吸附Cd的含量小球藻生长吸附Cd的含量图16春马大桥红树林图17青梅港红树林小球藻生长吸附Cd的含量小球藻生长吸附Cd的含量由图14-17可得小球藻生长过程中所吸附的Zn以及Cd的含量，小球藻对于金属Zn的吸附量比对Cd的吸附量大，与图6-9土壤浸出液中金属原有的含量对比可以计算出小球藻对Zn和Cd的吸附率。表4春马大桥红树土壤浸出液培养的小球藻对Zn和Cd的吸附率春马大桥红树林深度（cm）Zn吸附率（％）Cd吸附率（％）0-599.073.65-1087.973.610-1582.971.615-2086.849.9表5青梅港红树土壤浸出液培养的小球藻对Zn和Cd的吸附率青梅港红树林深度（cm）Zn吸附率（％）Cd吸附率（％）0-579.865.05-1080.834.310-1576.141.215-2068.337.8两个地区小球藻对Zn以及Cd的吸附率规律相同，都为Zn的吸附率＞Cd的吸附率，两个地区之间Zn和Cd的吸附率差别较大，并且春马大桥红树林地区土壤浸出液培养的小球藻对两种金属的吸附率都大于青梅港地区的。4.2.3测定土壤浸出液培养小球藻的OD680值的结果图18春马大桥土壤浸出液培养小球藻的生长情况图18春马大桥土壤浸出液培养小球藻的生长情况图19青梅港土壤浸出液培养小球藻的生长情况图19青梅港土壤浸出液培养小球藻的生长情况空白对照组海水培养的小球藻测得藻液的OD680值为2.084，根据图18和图19可知用两个地区的土壤浸出液培养的小球藻的OD680值均比2.084大，从而可以得出总体上用土壤浸出液培养小球藻可以促进其生长。4.2.4小球藻吸附Zn和Cd的含量与OD680值的Pearson相关性表6春马大桥土壤浸出液中小球藻吸附的Zn和Cd的含量与OD680的相关性OD680值Zn含量Cd含量OD68010.5270.382Zn含量10.154Cd含量1表7青梅港土壤浸出液中小球藻吸附Zn和Cd的含量与OD680的相关性OD680值Zn含量Cd含量OD68010.762**-0.625*Zn含量1-0.348Cd含量1注：**在0.01级别（双尾），相关性显著；*在0.05级别（双尾），相关性显著。由表6和表7结果所示，用春马大桥红树林土壤浸出液培养的小球藻的OD680值与所吸附的Zn含量存在一定的正相关性，但与吸附的Cd的含量不存在相关性。而青梅港红树林土壤浸出液培养小球藻的OD680值与吸附的Zn含量呈现显著正相关性，当所吸附的Zn含量增加，OD680值也随之增大，吸附的Cd含量呈现显著负相关性，当所吸附的Cd含量增加，OD680值也随之减小。5结论根据我们的实验结果，可以明显看出红树土壤浸出液对海洋小球藻的生长具有显著影响。我们可以发现红树林土壤浸出液的颜色、盐度以及重金属含量均存在一定的差异。这些差异可能会对海洋小球藻的生长产生影响。首先，从土壤浸出液的颜色来看，随着土壤深度的增加，浸出液的透明度增加。这可能是由于随着土壤深度的增加，土壤中的有机物和其他色素物质逐渐减少，使得浸出液的颜色变得更清澈。而这种颜色的变化可能会影响藻类的光合作用，从而影响其生长。其次，从土壤浸出液的盐度来看，同一地区的红树林土壤在0-20cm的深度中，土壤深度越深，浸出液的盐度较高，这种盐度的变化可能会影响藻类的渗透压平衡，从而影响其生长和代谢。在重金属含量方面，我们发现土壤浸出液中的Zn和Cd含量较高，但经过小球藻吸收后，含量均有所降低。这表明小球藻在生长过程中能够吸收并利用这些重金属元素，从而可能具有一定的重金属耐受性和富集能力，并且在同一地区Zn被吸附量要大于Cd被吸附量，此外，我们还发现不同地区、不同深度的土壤浸出液培养的小球藻对重金属的吸收规律有所不同，这可能与土壤浸出液中的其他成分以及小球藻的生理特性有关。通过对比实验组和对照组的的OD680值，我们发现用土壤浸出液培养的小球藻生长状况普遍优于空白对照组。这说明土壤浸出液中可能含有一些促进小球藻生长的营养物质或微量元素。同时，我们也注意到，不同地区的土壤浸出液对小球藻生长的影响程度有所不同，这可能与土壤本身的性质以及环境因素有关。通过小球藻吸附Zn和Cd的含量与OD680值的Pearson相关性结果分析，可得土壤浸出液中锌是会被释放出来的一类重要金属，也是小球藻生长一种必需元素，低浓度的Zn可以促进小球藻的生长，而土壤浸出液中的Cd有毒性对小球藻可能会有抑制效果，但土壤浸出液中含量较少，相对于Zn的吸收较少，没有起到很强的抑制作用。然而，不同地区的土壤浸出液对小球藻生长的影响程度可能存在差异。这可能是由于不同地区土壤浸出液中的营养物质和微量元素的种类和含量不同所致。6展望本实验通过制备红树林土壤浸出液并研究其对海洋小球藻生长的影响，发现土壤浸出液中的颜色、盐度和重金属含量均可能对藻类的生长产生影响。同时，实验结果也表明总体上用土壤浸出液培养小球藻可以促进其生长。然而，不同地区、不同深度的土壤浸出液对藻类生长的影响程度可能存在差异。为了更深入地了解红树土壤浸出液对海洋小球藻生长的影响机制，未来的研究可以从以下几个方面展开：首先，可以进一步分析不同地区、不同深度的土壤浸出液中的营养物质和微量元素的种类和含量；其次，可以研究不同浓度的土壤浸出液对藻类生长的影响；最后，可以探讨红树林土壤浸出液中的重金属对藻类生长的影响机制及其生态风险。此外，红树林作为一种重要的湿地生态系统，在维护海洋生态平衡和生物多样性方面发挥着重要作用。因此，未来的研究还可以关注红树林生态系统的保护和恢复，以及如何通过合理利用红树林资源来促进海洋生态的可持续发展。参考文献刘景春,严重玲.福建漳江口红树林湿地沉积物中四种重金属的空间分布特征[J].亚热带植物科学,2006,(04):1-5.Sánchez-Quiles

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