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DB12RT-PCRassayfordetectionofporcinedeltacoronavirus天津市市场监督管理委员会发布I本标准按照GB/T1.1-2009给1猪德尔塔冠状病毒RT-PCR检测方法本标准规定了猪德尔塔冠状病毒（porcinedeltacoro仪器设备与试剂、样品对照、方法步骤和结果判定等技本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PDCoV核PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcinePCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreactRT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerRNA：核糖核酸（ribonucleicTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribM-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurinelPBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffPDCoV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PDCoVM基因保守基因伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。依据PCR试验结果，判断样品中是否含有PD4主要仪器设备2聚合酶、dNTP、DL2000DNAMarker、核酸染料、磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2）、TAE电PDCoVM基因PCR扩增方法所用引物见表1.5mL离心管、剪刀、镊子和棉拭子，经121(±2）℃,15min高压灭菌，50℃~60℃烘干备用。将采集的样品放入保温箱中，加入干冰，密封，24h内送至实肠组织及肠内容物：剪碎，用组织研磨机充分研磨，并按照质量体积比1:5加入PBS，冻融3次，转细胞培养物：冻融3次，转入1.5mL离心管中，4000rpm/m37.2.2向各管中加入200μL2℃~8℃预冷的氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min。dNTP2μL，随机引物1μL，M-MLV反转录酶0.5μL条件为：30℃10min，42℃1h，99℃5min。得到的cDNA溶液直接用于下面的PCR扩增或者-20℃冻dNTP2μL，上游引物P11μL，下游引物P21μL，cDNA4μL将PCR扩增产物8μL与2μL上样缓冲液混合，点样于1％琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一），45A.1PBS缓冲液A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠71.6g，加适量灭菌去离子水溶解，定容至1000A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠27.6g，加适量灭菌去离子水溶解，定容至1000A.1.3量取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液36用灭菌去离子水溶解稀释至1000mLA.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）A.2.2TAE电泳缓冲液（50×)0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(

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