DB12T 527-2014 奶牛结核病净化技术规范

DB12DB12/T527—2014奶牛结核病净化技术规范ThetechnicalstandardforcleaningofBovineTuberculosisindairycattle天津市市场和质量监督管理委员会发布I1牛结核病BovineTubercu24检测方法4.1牛型结核分枝杆菌PPD（提纯蛋白衍生物）皮内4.2γ-干扰素ELISA试验作为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验5.1.4检测时，首先用牛型结核分枝杆菌试验检测，如γ-干扰素ELISA试验牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验和γ-干扰素反应试验结果阳性或可疑牛须与受威胁的5.3.1扑杀对确认的结核病阳性牛5.4.1紧急消毒奶牛群中检出并剔出结核病阳性牛后，对污染的场所、用具、物品进行严格消毒。饲养场的金属设施、设备采取火焰、熏蒸等方式消毒；饲进行一次大消毒，分娩室在临产牛生产前及分娩后各35.5.1异地调运的奶牛，必须来自于非疫区，应当符合农业部物检疫管理办法》相关规定隔离饲养30从事奶牛饲养和管理的人员每年要进行健康检查，发现患有6净化群（场）的认定7净化群（场）的维持7.2发现阳性牛按照本规范5.3规定处理，同群牛按本规范5.1.2要求检测。4γ-干扰素ELISA试验A.1.1牛结核分枝杆菌γ-干扰素ELISA试剂盒（内含酶标板、牛γ-干扰素阳性对照、牛γ-干扰素阴A.1.2牛型提纯结核菌素（牛型PPA.1.4肝素钠真空管A.1.5孔组织培养板A.1.6单道可调移液器及配套吸头（20µL-200µL、100µL-1000µL、1mL-A.1.7道移液器及配套吸头（50µL-300µL）A.1.9有盖离心管（1.5A.1.10恒温CO2培养箱A.1.12洗板机A.2.3酶标结合物稀释液用去离子水或蒸馏水重新溶解5倍浓缩的酶标结合物稀A.2.4牛γ-干扰素阳性对照用1mL去离子水A.2.5牛γ-干扰素阴性对照用1mL去离子水A.2.6洗液用去离子水或蒸馏水重新溶解20倍浓缩的洗A.2.7显色剂溶液将100倍浓缩的显色剂溶液用底物缓冲液做100倍稀释配A.3.1临床样本采集及预处理A.3.1.1样本的采集牛静脉无菌采血5mL，放入肝素钠血后8h（最长不超过30h）内用于检测。A.3.1.4加入牛型PPD、禽型PPD和PBS向24孔培养板中每份样品对应的3个孔分别无菌加入100A.3.1.5全血孵育过夜将全血培养板置CO2培养箱内，37℃孵育18h（全血可接受培养时间为16~5A.3.1.6收获血浆经过18h培养，用移液器A.3.2检测方法A.3.2.1试验前将酶标板和所有试剂恢复到室温，试剂充分混匀。A.3.2.2向酶标板中的96孔中分别加入50μL血浆稀释缓冲液，再向相应孔中加入50μL待测样品和牛γ-干扰素阴、阳性对照样品。对照样品应最后加入。充分振荡1min，彻底混匀。封板，±5）℃]孵育60±5）min］。用洗板机洗涤6次，将酶标板放在干净的滤纸上拍A.3.2.3每孔加入100μL稀释好的酶标结合物，充分振荡混匀。室温孵育（60±5min洗涤6次。A.3.2.4每孔加入100μL新鲜配制的显色剂溶液，充分振荡混合。室温避光孵育30min。A.3.2.5迅速加入50μL终止液，轻轻摇动混匀。A.3.2.6终止后5min内读出OD450值，然后用OD450值计算结果。A.3.3.1满足以下2个条件试验方成立牛γ-干扰素阴性对照OD450值<0.13，且阴性对照重复孔OD450值差≤0.04；牛γ-干扰素阳性对照OD450值>0.7。A.3.3.2计算每头动物所有样品（包括加入牛型PPD、禽型PPD和PBS）的OD450值阳性=牛型PPD的OD450值-禽型PPD的OD450值≥0.1，且牛型PPD的OD450值-P