【基地班生物化学大实验讲义】酸性磷酸酯酶的提取VIP

【基地班生物化学大实验讲义】酸性磷酸酯酶的提取实验一、酸性磷酸酯酶的提取分离纯化一、目的掌握胞内酶的分离提取方法，学会离心机的使用。二、原理酸性磷酸酯酶(AcidPhosphatase，EC3．1．3．2)存在于植物的种籽、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性地水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(μmo1)产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin一酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验采用的是Folin-酚法。实验前将绿豆芽细胞破碎，释放出酸性磷酸酯酶，离心除去细胞碎片和植物纤维等杂质，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，为下面的酶学性质研究及SDS电泳法测分子量等系列生物化学实验做准备。三、实验器材1．LGl0—2.4A高速离心机：北京医用离心机厂生产，1台／组2．托盘天平：1台／组。3．滴管：1支／组。4．100mL烧杯：2只／组。5．100mL三角烧瓶：1只／组。6．漏斗：1只／组。7．纱布：若干。8．滤纸：若干。9．碾钵：1套／组。10．培养皿：1个／组。11．100mL量筒：1支／组。12．塑料手套：多双／组。13．记号笔：公用。14．绿豆芽：当日采摘，50克／组。15.SephadexG-150均为pharmaeia产品。四、实验试剂1.0.01mol/LHAc一NaAc缓冲液：2.0.2mol/LNaOH溶液3.5.5mmol/LPNPP（对硝基苯磷酸二钠）五、操作1．匀浆：戴上手套，将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取50g的绿豆芽茎，在碾钵中用碾锤彻底捣碎，室温静置0.5h，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。2．平衡：将2只100mL烧杯分别放到托盘天平的2只托盘上进行平衡。将滤液倒人2支离心管中，再把离心管连同其盖子分别放入托盘上的2只烧杯中，用滴管增、减离心管中的溶液使其在托盘天平上进行平衡，平衡后盖上离心管的盖子，用记号笔做好标记。3．离心：4000r／min离心20min。4．保存：将离心管中大部分上清液倒人量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后倒入三角烧瓶中．做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。5、将原酶液精确等分，一部分在冰箱中保存备用。另一部分用于实验六的sephadexG-150柱层析。6.酶活力的测定将pNPP溶于0.1mmol/LHAc-NaAc缓冲液中配成5.5mmol/L底物溶液，每lmL底物溶液加入0.2mL酶液，37oC保温1小时，再加入4mL0.2mol/LNaOH溶液终止反应，混匀后测405nm光吸收值。以先在底物溶液中加入4mL0.2mol/LNaOH溶液后再加入0.2mL酶液作对照。在此条件下，以每小时催化释放1umol对硝基苯酚的酶量定义为1个活力单位。五、计算上清液体积（mL）粗酶液得率（mL）=上清液体积绿豆芽茎质量×100%六、注意事项1．使用离心机前必须将离心管(连同其盖子)精确平衡。2．离心过程中，若听到异常响声，可能是出现了离心管破碎或离心管不平衡等情况，应立即切断电源，停止离心，检查原因3．在离心机高速运转过程中切勿打开离心机盖，以防造成意外事故。4．避免离心机连续使用时间过长，一般使用60min后要隔20~30min再使用。5．有机溶剂会腐蚀离心管，酸、碱、盐溶液会腐蚀金属，若发现渗漏现象应及时擦洗干净．以免损坏离心机。思考题1．实验操作过程中为什么需戴上手套？2．豆芽在碾钵中用碾锤彻底捣碎对酶液提取起到什么作用?3．离心管中的沉淀物可能是哪些成分？实验二、酶促反应进程曲线的制作一、目的学会制作酶促反应的进程曲线，掌握可见分光光度计的使用。二、原理要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。要求出代表酶促反应初速度的时间范围就必须制作酶促反应的进程曲线。所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明了酶促反应随反应时间变化的情况。本实验的进程曲线是在酶促反应的最适条件下采用每间隔一定的时间测定产物生成量的方法，以酶促反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成的。从进程曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶促反应的初速度。但是，随着反应时问的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶促反应时间成正比的这一段时间内进行测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。制作进程曲线，求出酶促反应初速度的时间范围是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。三、实验器材1．VIS-7220型可见分光光度计2．HH一2型数显恒温水浴锅3．取样器：请参见实验一，5mL、1mL。各1支／组。4．试管：20支／组。5．试管架：1个／组。四、实验试剂1．酸性磷酸酯酶酶液：取原酶液用0.2mol／L的pH5．6乙酸盐缓冲液稀释10～20倍。2．5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)：精确称取磷酸苯二钠(C6H6Na2PO4·2H2O，相对分子质量254.10)2.54g，加蒸馏水溶解后定容至100mL，即配成了100mmol／L磷酸苯二钠水溶液，密闭保存备用。用0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)。3．0.2mol／L的pH5.6乙酸盐缓冲液。4．Folin-酚试剂：于2000mL磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g，水700mL，85％磷酸50mL，浓盐酸100mL。微火回流10h后加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL和溴数滴摇匀。煮沸约15min，以驱逐残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色；如仍呈绿色，须重复滴加液体溴的步骤。冷却后定容到1000mL，过滤，置于棕色瓶中可长期保存，使用前，用蒸馏水稀释3倍。5．1mol／L碳酸钠溶液。6．0.4mmol／L酚标准应用液：精确称取分析纯的酚结晶0.94g溶于0.1mol／L的HCl溶液中，定容至1000mL，即为酚标准贮存液，贮存于冰箱可永久保存，此时的酚浓度约为0.01mol／L。使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释25倍，即得到0.4mmol／L酚标准应用液。五、操作检查试管是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。1．加样与酶促反应：取试管12支，按0到11的顺序逐管编号，空白为0号。各管加0.5mL5mmol／L磷酸苯二钠溶液，在35℃恒温水浴锅中预热2min后，在1～11管内各加入0.5mL预热的酶液。酶液一加入立即精确计时井摇匀，按时间3、5、7、10、12、15、20、25、30、40和50min在35℃恒温下进行定时酶促反应(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加人时为终止时间)，参见图8—2一4。当酶促反应进行到上述相应的时间时，加入1mol/L碳酸钠溶液5mL终止反应，时间控制详见表。管号1234567891011109876543210酶液加入时刻（min11号试管最先加样）1314151718202428324150碳酸钠加入时刻（min）2．显色：加完1mol／L碳酸钠溶液5rnL后再向试管中加入0.5mLFolin一酚稀溶液，混匀，保温约10min即可显色。空白管所加试剂相同，但酶液最后加入。3．测定：冷却后以0号管作空白，在可见光分光光度计上680nnl波长处测定各管的吸光度A680。酶促反应操作安排管号123456789101105mmol/L磷酸苯二钠溶液各0.5ml酶液（35℃预热过的）各0.5ml，一加入就计时，注意合理安排各管的加入时间，最好先加第11管，隔1min再加第10管（详见表8-2-1）35℃精确反应时间（min）35710121520253040501mol/L碳酸钠溶液各5mL（用于终止反应）Folin-酚稀溶液各0.5mL0号试管加入酶液0.5mL35℃保温显色10min以上A68004．画图：以反应时间为横坐标，A680为纵坐标绘制进程曲线，并将其贴在实验报告上，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围(直线部分涵盖的时间)。5．清洁：将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。六、计算试管1234567891011A680初速度的时间范围：0～min七、注意事项1．酶促反应应保持温和条件，反应液要避免剧烈搅拌或震荡。2．实验前要设计好每支试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。3．酶促反应的加样顺序不得搞错，否则无法显色。思考题1．随着反应时间的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低，这是为什么？2．如果酶促反应在一个较大的体系中，如在烧杯中进行，每隔一定的时间从烧杯中取样测定该体系中产物的生成量，并绘制酶促反应进程曲线，该方法和本书采用的方法结果会一致吗?哪个更好一些？实验三、酸性磷酸酯酶的酶活力测定一、目的通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。二、原理请参见实验一三、实验器材请参见实验二四、实验试剂请参见实验二五、操作检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。1．标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。按照表8—3—1，向各试管中依次加入0.4mmol／L酚标准应用液、0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1mol／L碳酸钠溶液和Folin一酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。摇匀，在35℃保温10min以上(先用烧杯盛35℃的水，置于水浴锅中，再将试管放人烧杯中保温，以防试管滑落人水中)，参见实验八(2)的图8—2—4。以0号试管为空白，在可见光分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680为横坐标、酚标准应用液的毫升数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。保留该数据，以便实验八(4)直接引用。以上操作总结为表标准曲线的制作试管1234500.4mmol/L酚标准应用液0.10.20.30.40.500.2mol/LpH5.6的乙酸盐缓冲液（mL）0.90.80.70.60.511mol/L碳酸钠溶液（mL）5Folin-酚试剂（mL)0.5摇匀，在35℃保温显色10min以上A68002．酶活力的测定取2支试管，编号1’,0’，将0’号试管作为空白。在2支试管中备加人0.5mL的5mmol／L磷酸苯二钠溶液，35℃预热2min，再向1’号试管中加人35℃预热过的酶液0.5mL，立即计时，摇匀，35℃精确反应10min(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加入时为终止时间后立即向2支试管中各加入1mol／L碳酸钠溶液5mL，再各加人Folin-酚稀溶液0.5mL，混匀，最后向0’号试管中加入酶液0.5mL，2支试管摇匀后在35℃保温显色约10min以上，将0’号试管作为空白，用可见光分光光度计测1导试管在680nm处的光吸收值A680，以上详细的加样顺序和操作见表，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。管号1’0’5mmol/L磷酸苯二钠溶液（mL）0.50.535℃预热2min酶液（35℃预热过的）（mL），一加入就计时0.50摇匀，35℃精确反应10min后立即加入1mol/L碳酸钠溶液5mL（终止反应用）Folin-酚稀溶液（mL）0.50.50’号试管加入酶液0.5mL摇匀，35℃保温显色10min以上A6800酶活力测定3．酶活力的计算酶活力单位的定义为：在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(μmol)产物所需要的酶量规定为一个活力单位。用1号试管的A680在标准曲线上查出其对应的酚标准应用液的毫升数V，根据公式：2×0.4×V×1000/10可计算出lmL酶液中所含有的酶的活力。4．清洁将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。六、计算试管00’123451’A68000V（mL）1mL酶液的活力（U）七、注意事项参见实验二的注意事项。思考题1．用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷都可以用来测定酸性磷酸酯酶的活力，你认为哪种方法的适应面更广?2．测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行?3．空白管中为什么最后才加酶液?你还可以设计出另一种空白管吗?实验四凝胶层析法纯化酸性磷酸酯酶一．实验目的掌握凝胶过滤层析测定原理和实验方法，掌握凝胶过滤柱的使用以及葡聚糖凝胶G-150的使用及保存。二．实验原理（一）凝胶过滤层析原理凝胶过滤（gelfiltration），又称为凝胶层析（gelchromatography）、分子筛过滤（molecularsievefiltration）、凝胶渗透层析（gelosmoticchromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。见下图：用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯–2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说SephadexG–l0～15通常用于分离肽及“脱盐”。SephadexG–75～200用以分离各类蛋白质。凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液。（二）层析操作（1）凝胶溶胀（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表：必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。（2）装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生“管壁效应”，即柱中部分的物质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。凝胶层析中，在把小分子物质（mw<1500），如无机或其他物质与大分子物质（mw<20000）分离时，层析柱的体积一般约为样品的4–10倍，高度与直径的比例为5：1至15：1之间。这类柱也称为“脱盐”柱，常用网孔很小的凝胶如G–25。用以将生物大分子物质彼此分开的分级层析柱，体积应为样品体积的25～100倍。柱长度与直径的比例为20：1～100：1。装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱床一般应离柱顶3~5cm，并覆盖一层溶液。灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的部分再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖–2000（Bluedextran–2000）通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。（3）平衡装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。（4）上样将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐”层析时，上样体积可为柱体积的10%～25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%～5%。样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.08，以免产生特异性吸附。上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（3～5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。（5）洗脱用规定的溶液流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗脱液放在贮液瓶（洗脱瓶）中并与层析柱相通连。洗脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出。洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出；过慢时已分离的分子会因扩散而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决于它的静水压。静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接触空气的两个液面间的高差），这个高度差越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减；或者降低或提高层析柱出口的位置等，因此静水压又称操作压。由于静水压越大，洗脱液的流速就越快。在固定洗脱瓶与出口位置的情况下，静水压会在洗脱过程中，随着洗脱瓶中溶液减少液面不断下降而减少，难以维持流速的恒定。为了解决这个问题，Marriotte首次将洗脱瓶加塞塞紧，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脱液的底部，这样洗脱液的静水压便等于此玻管下口的液面高出层析柱出口液面的高度（因为当洗脱瓶液体流出时，瓶顶形成真空，空气只从玻璃管中进入，玻管下口即为接触空气点），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增减将不影响静水压，从而自动保持了流速的恒定，此洗脱瓶称为恒压瓶，也叫马氏瓶。当然，当洗脱液减少至液面低于玻管的下口时，便会失去作用，但这时可用及时加入洗脱液来解决。在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为G–75以上的软胶胶体柔软易变形，对静水压仅有一定的承受能力，不同软胶的承受能力也不相同，静水压超过凝胶的承受能力时，最初流速会很快；其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件。脱盐一般使用的是G–25属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小，实验过程中的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺旋夹控制在0.5ml/min左右，随着洗脱液的流出，样品逐步被分开。用试管收集洗脱液，按顺序每管收集2ml。（6）检测在收集的同时，检查蛋白质是否流出。以光密度值为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线，用以表示被分离物质流出的状态。（7）凝胶的洗涤及保存由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。凝胶长期不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡，再换一下浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。三．试剂与器材１、凝胶过滤柱（1.0*60cm）２、层析柜３、紫外检测仪４、恒流泵５、馏分自动收集器６、记录仪７、葡聚糖凝胶G-150四．实验步骤取SephadexG-15025g于500ml水中，煮沸5小时，得到溶胀完全的凝胶。取30cm的层析柱，垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的SephadexG-150中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的SephadexG-150，使凝胶自然沉降，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液以3倍柱体积的醋酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将粗酶液样品1.5ml（浓度尽量大一点，可用反相透析法浓缩酶液，加样量约为柱体积的2%~5%）加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.01mol/L，pH5.0的醋酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液，每管3ml。在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。当检测器和记录仪中的数值开始变化时用记号笔标记管号。当数值重新恢复到“0”值时层析结束。整理记录仪上的记录纸，进而确定含有目的酸性磷酸酶的试管。收集试管，重复【实验三酸性磷酸酯酶的酶活力测定】，确定各管酶活力的变化，绘制酶活曲线。同时将记录纸上的曲线绘制到实验报告之上，即为蛋白曲线。将具有酶活力的试管合并，用考马斯亮蓝法检测其中的蛋白含量，同时测量酶活力，得出单位质量的酶活。与粗酶液比较纯化前后单位质量的酶催化活性的变化。五．注意事项①装柱后，凝胶要始终处于缓冲液浸泡中，液面不能低于凝胶。加样时尤其要注意。②保持凝胶表面水平，没有凹陷或凸起。洗脱液必须沿凝胶柱管壁流到液面，不能滴到液面上，防止凝胶变形。③由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。六．思考题①画出层析装置的连接示意图。②常用于凝胶层析的凝胶都有哪些？③查找资料，阐述一下层析的分类。实验五考马斯（Comessie)亮兰结合法测定蛋白质浓度一．目的掌握考马斯亮蓝法检测蛋白含量的方法。二．原理考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮兰G250-蛋白质定量测定的高敏性度。在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595nm下，光密度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。优缺点：(—)操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。(二)显色迅速。约于2分钟内完成染料与蛋白质的结合。所现颜色至少在l小时内是稳定的。(三)与改良Lowry氏法相比，干扰物质较少。(四)当样品中存在较大量的十二烷磺酸钠(SDS)、TritonX-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。(五)考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。(六)微量法测定蛋白含量范围为1-10μg；常量法测以检测范围10-100／μg为宜。三．器材(一)试管l0支(二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。（三）721分光光度法，普通比色杯4只。四．试剂(一)O.9％NaCl(二)待测粗酶液和层析后酶液(三)标准蛋白(四)染液：考马斯亮兰G2500.1克溶于0.5m195%乙醇。再加入100m185％(W／V)磷酸。然后加蒸馏水定容到1000ml。[此时溶液为0.0l％考马斯亮兰G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。五．操作(常量法)(一)标准曲线制备：配制lmg／ml的标准蛋白溶液。制备系列稀释液，其浓度分别为1000μg／ml，500μg／ml，250μg／ml，125μg／ml，62.5μg／ml和31.25μg／ml。按下表操作：摇匀，室温静置3分钟。在第一管为对照管，在721型分光光度计于波长595nm处比色-读取光密度。以各管光密度为纵座标，各标准样品浓度(μg／ml)作为横座标作图得标准曲线。(二)未知样品测定：取样品稀释不同倍数，分别测量吸光度，最后选择落在标准曲线范围内的稀释倍数进行计算。取试管二只，按下表操作：摇匀，静置3分钟，在721型分光光度计亡波长595nm比色，读取光密度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白质浓度。【计算】未知样品蛋白质浓度μg／ml＝稀释样品浓度×稀释倍数实验六酸性磷酸酯酶米氏常数的测定一、目的掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定原理和实验方法，掌握可见分光光度计的使用。二、原理请参见实验一根据酶与底物形成中间配合物的学说，可以得到一个表示酶促反应速度与底物浓度之间相互关系的方程式，这就是酶学上著名的米氏方程：式中。[S]为底物浓度，v为反应速度，Vm为最大反应速度，Km为米氏常数。由米氏方程可以推出，米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol／L或mmol／L)。测定Km和Vm，特别是测定Km，是酶学工作的基本内容之一。在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是酶的一个基本特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，Km数值越大，说明酶与底物的亲和力越弱；反之，Km值越小，说明酶与底物的亲和力越强，Km值最小的底物就是酶的最适底物。测定Km和Vm，一般通过作图法求得。作图方法很多，其共同特点是先将米氏方程式变换成直线方程，然后通过作图法求得。本实验在测定酸性磷酸酯酶以磷酸苯二钠为底物的Km和Vm时，采用最常用的双倒数作图法(Lineweaver-Burk作图法)。这个方法是先将米氏方程两边同时取倒数，整理后得到：然后以1/v对1/[S]作图，可得到一条直线。这条直线在横轴上的截距为1/Km，在纵轴上的截距为1/Vm，由此即可求得Km和Vm三、实验器材请参见实验二四、实验试剂请参见实验二五、操作检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120~C烘干。1、酚标准曲线的制作做过实验三的同学此步可免，直接应用上次的酚标准曲线。未做过实验三的同学，请按实验三中“标准曲线的制作”的操作，先制作酚标准曲线，保留该数据，以便实验四直接引用。2、底物浓度对酶促反应速度的影响一一Km和Vm的测定参见表取试管7支，按照0至6的顺序逐管编号，空白管为0号。1～6号管加入不同体积的5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)，并分别补充0.2mol／L的pH5．6乙酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min(先用烧杯盛35℃的水，置于水浴锅中，再将试管放入烧杯中保温，以防试管滑落水中,逐管加入35℃预热过的酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，开始计时，摇匀，精确反应10min(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加入时为终止时间)。反应时间到达后立即加入5mL1mol／L碳酸钠溶液，再加0.5mLFolin酚稀溶液，摇匀，35℃保温显色约10min。0号管内先加入0.5mL5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)，再加入5mLlmol／L碳酸钠溶液和0.5mLFolin-酚稀溶液，最后加入0.5mL酶液，其他操作与1～6号管相同。冷却后以0号管作空白，在VIS一7220型可见分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度A680。Km和Vm的测定管号12345605mmol／L磷酸苯二钠溶液（mL）0.10.140.20.250.330.50.50.2mol／L的pH5．6乙酸盐缓冲液（mL）0.40.360.30.250.170035℃预热2min左右35℃预热过的酶液（mL）（加入就计时，即起始时刻）0.50.50.50.50.50.5暂不加摇匀，在35℃的条件下，精确反应10min（注意合理安排各试管的酶液加入时间，也就是反应的起始时间，最好间隔1min）各管内均加入1mol／L碳酸钠溶液5mL（用于终止反应）各管内均加入Folin-酚稀溶液0.5mL，摇匀向0号管加入酶液0.5mL摇匀，所有试管在35℃保温显色10min以上A6800用各管的A680在标准曲线上查出其对应的酚标准应用液的毫升数V，则产物的浓度为0.4×V(mmol／L)，这样，各种底物浓度下的速度v=0.4×V／10(mmol／(L·mL·min))，取相应的倒数，填表8-4-2内。以l/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，求出Km和Vm。3、将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，井注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。六、计算记录与计算汇总管号123456A680V（mL）磷酸苯二钠浓度（mmol/L)0.50.71.01.251.652.51/[S]2.01.421.00.80.60.4反应时间（min）101010101010反应速度v（mmol·mL·min1/vKnVn七、注意事项参见实验二之注意事项。思考题1．为什么要用双倒数作图法而不是直接用米氏曲线来求米氏常数?2．还有其他作图法可以准确求出米氏常数吗?试用本实验的数据，通过两种作图法来求米氏常数，并比较差异。实验七、酸性磷酸酯酶的检测——SDS电泳法一、目的熟悉垂直板型电泳槽的使用，了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量以及检测样品中蛋白质组分的一般原理，掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法。二、原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N’，N’四甲基乙二胺(N，N，N’，N’tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(anmoniumpersulfate(NH4)2S208，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2)的作用下集合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(pelyacrylamidegeIelectrephoresls，简称PAGE)。用普通凝胶电泳分离大分子物质，主要依赖于各大分子所带电荷的多少、相对分子质量的大小及其分子的形状等差异。而要利用凝胶电泳测定大分子的相对分子质量，就必须将大分子所带电荷和分子形状的差异所引起的效应去掉或将其减少到可以忽略不计的程度，从而使大分子的迁移率完全取决于它的相对分子质量。为了达到上述目的，目前较常用的方法是在电泳体系中加入一定浓度的十二烷基磺酸钠(Sodiumdedecylsufate，SDS)。SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子的氢键和疏水键，使蛋白质变性为松散的线状，在强还原剂β一巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成组成它们的多肽链，解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。蛋白质SDS复合物所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，而且此复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒，它的短轴对不同的蛋白质亚基SDS复合物基本上是相同的，约为180A(1.8×10-8m)，但长轴的长度则与蛋白质亚基相对分子质量的大小成正比，因此