T-GXTC 0011-2024 基于酶联免疫法（ELISA）甘蔗宿根性早期评价

ICS65.020.20CCSB05GXTC（完成时间：2024年7月3日星期三）T/GXTC0011—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西壮族自治区亚热带作物研究所提出并宣贯。本文件由广西热带作物学会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区亚热带作物研究所、广西大学生命科学与技术学院、广西高丰农业有限公司。本文件主要起草人：程琴、李茹、周全光、农泽梅、吕平、卢业飞、欧克纬、王丽萍、李慧敏、曾1T/GXTC0011—2024基于酶联免疫法（ELISA）甘蔗宿根性早期评价本文件规范了基于酶联免疫法（ELISA）甘蔗宿根性早期评价的术语和定义、原理、材料和试剂、仪器设备、检测步骤和数据处理。本文件适用于甘蔗组培苗、种苗、种茎及大田植株的宿根蔗宿根性的早期评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1甘蔗宿根性Sugarcaneperennial甘蔗宿根性是指甘蔗在收斩后留下的地下蔗茎和根系继续存活并再次发株的能力，其强弱表现在宿根发株的快慢强弱和数量，最终成茎率、有效茎数和产蔗量高低等。3.2酶联免疫法Enzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合的专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。3.3缩略语Acronym下列缩略语适用于本文件。ABA:脱落酸(Abscisicacid)IAA:生长素(Indoleaceticacid)GA3:赤霉素(Gibberellin)CAT:过氧化氢酶(Catalase)SOD:超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)PAL:苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase)SS:蔗糖合成酶(Sucrosesynthase)4原理在甘蔗宿根性的研究中，植物激素如生长素（IAA）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）等，可能影响蔗芽的萌发、根系的发育和植株的整体生长。过氧化氢酶（CAT）、植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）与宿根性正相关，而植物蛋白酶（Prot）、植物蔗糖合成酶（SS）指示植物对逆境的响应能力，它与宿根性负相关。通过测量与这些过程相关的激素和酶含量，可以间接反映甘蔗的宿根性。样品经处理后，采用ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附分析，用酶标仪在相应波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物激素和酶的浓度。2T/GXTC0011—2024将得到内源激素和酶的浓度值，采用改进的极点排序法进行评分，得到各指标的的权重系数，根据鉴评矩阵得到各品系各指标的对应得分，得分与各指标权重系数相乘即为最后综合评价值，综合评价值越高，说明该品系的宿根性越好。5材料和试剂5.1材料种植在同一地块、同种栽培管理方式、同一宿根年限、不同甘蔗品种的宿根蔗，采取甘蔗萌发初期的幼根为检测材料。5.2试验设计及田间管理试验采用随机区组田间设计，5行区，行长7m，行距1.2m，每个品种种植3个小区。新植蔗当年3月种植，采用双芽种茎以双行品字形排列种植，下种密度为12.8芽/m。新植蔗成熟后于次年1月收获，保留宿根，宿根蔗次年1月收获。新植蔗和宿根蔗的田间管理均与当地甘蔗高产栽培管理相同。5.3ELISA试剂盒IAA检测试剂盒、ABA检测试剂盒、GA3检测试剂盒、CAT检测试剂盒、SOD检测试剂盒、Prot检测试剂盒、PAL检测试剂盒、SS检测试剂盒。除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中三级水的要求。见附录A。6仪器设备6.1分光光度计波长范围（325nm～800nm），波长准确度(±2nm）。6.2酶标仪波长范围（200nm～1000nm）,精度：SD<0.001Abs或CV<0.5%，@450nm(0Abs～3Abs)。6.3培养箱控温范围：RT+5～RT+65，输入功率：450W，定时范围：1min～9999min。6.4移液器10µL～100µL、20µL～200µL、100µL～1000µL。6.5离心机转速100rpm～14800rpm，步长100rpm，容量1.5mL/2.0mL×24，温控-20℃~40℃。7检测步骤7.1试样的采集与准备在宿根蔗萌发出芽，二叶期开始取样，挖取蔗蔸，剪取嫩根进行内源激素、酶含量测定，每个样品取2g，每个样品3个重复，取样时先用清水洗干净根部，再用锡箔纸包好，写上标签，装在预冷的冻存管，迅速放入液氮保存备用。7.2样品溶液的准备取回的嫩根（步骤7.1）加入2mL生理盐水冰浴研磨捣碎，4℃,9550rpm离心10分钟，取上清液，待测。7.3标准曲线的绘制3T/GXTC0011—2024以水为参比液，在波长450nm处，用1cm比色皿在分光光度计上测定标准比色液的吸光度。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，求线性回归方程式。7.4试样的测定在酶标板上，标准品准确加稀释液50µL，待测样品孔中先加稀释液40µL，然后再加待测样品10µL。按照酶联免疫试剂盒所述操作步骤对待测试样（液）进行定量检测，重复三次。8数据处理8.1待测液浓度计算按照试剂盒说明书提供的计算方法以及计算机软件，将待测液吸光度代入7.3所获得标准曲线，计算待测液浓度。8.2宿根性强弱评价方法采用WPS软件进行数据处理和作图。将参与评价指标相对数据划分为5级。对每一品种所测指标相对值进行分级，使每一指标都得到相应级别值。公式为：D=(Hmax-Hmin)/5（1）E=[(H-Hmin)/D]+1（2）式中，Hmax为各指标相对数据最大值；Hmin为各指标相对数据最小值；H为各指标相对数据任意值；D为得分级差（每得1分之差）；E为各材料每个指标的级别值。通过计算可以得到鉴评矩阵。权重系数为每一指标在综合评价中的权重，计算公式为：任意指标权重系数B=任意指标变异系数/各指标变异系数之和（3）综合评价值其计算公式为：Vi=ΣEij×Bj（i=1，2…8；j=1，2…4）,（4）式中，Vi为每一份材料综合评价值；Eij为各相对数据的级别值；Bj为对应指标权重系数。8.3宿根性强弱判定标准甘蔗宿根性强弱根据综合评价值Vi确定，Vi