《金属纳米材料 水环境中原生动物四膜虫生物富集试验标准》

ICS号

中国标准文献分类号

中国城市科学研究会标准

T/CSUSXX-202X

金属纳米材料水环境中原生动物四膜虫

生物富集试验

Metallicnanomaterials—Bioconcentrationexperimentusing

theprotozoanTetrahymenaintheaquaticenvironment

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国城市科学研究会发布

1范围

本标准规定了对水环境中四膜虫进行生物富集试验的方法，包括术语和定义、

受试材料信息、试验方法、数据处理、质量控制、数据与报告。

本标准适用于水环境中金属纳米材料生物富集试验的指导。

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2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.0.1生物富集bioconcentration

受试生物从水体中蓄积某种物质的现象。

同义词：生物浓缩

2.0.2生物富集系数bioconcentrationfactor,BCF

受试生物体内受试材料含量与周围水体中该受试材料浓度的比值，也称生物

浓缩因子。

2.0.3吸收uptake

受试生物将受试材料从水体中转移至体内的过程。

2.0.4吸收速率uptakerate

暴露于含有受试材料的水体中，受试生物体内受试材料含量随时间增加的速

率。

2.0.5吸收速率常数uptakerateconstant,ku

暴露于含有受试材料的水体中，受试材料的吸收速率与其在水体中浓度的比

值。

2.0.6排出elimination/efflux

受试生物体内所蓄积的受试材料转移出生物体的过程。

2.0.7排出速率常数eliminationrateconstant,ke

假设受试材料的排出过程遵循一级动力学，生物体内受试材料含量在单位时

间内降低的比例。

2.0.8无可观察效应浓度noobservedeffectconcentration,NOEC

在给定测试周期内，与对照组相比，在统计学意义上对受试生物未产生显著

效应（p≥0.05）的最高受试物浓度。

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3受试材料信息

在开展生物富集试验之前，应提供受试材料（金属纳米材料）的以下信息：

a）形貌：主要指金属纳米材料的形状和表面特征。目前常用的仪器有扫描

电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）等。

b）粒径：主要指金属纳米材料的初始颗粒尺寸和分散在介质中的尺寸，金

属纳米材料的粒径会影响其在生物体内的富集。目前常用的测定仪器有动态光散

射粒度分析仪（DLS）、SEM、TEM和AFM等。

c）化学成分：主要指金属纳米材料的元素组成，是决定金属纳米材料性质

的基本因素。常用的分析仪器有X射线光电子能谱仪（XPS）、电感耦合等离子

体质谱仪（ICP-MS）、电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）、原子吸收光谱

仪（AAS）等。

d）结构特征：主要指金属纳米材料的晶型结构，可以通过X射线衍射仪

（XRD）、高分辨透射电子显微镜（HRTEM）等测定。

e）表面性质：主要包括金属纳米材料的表面官能团、表面电荷、比表面积

等。可借助傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）、Zeta电位分析仪、比表面积分析仪

等仪器分别得到金属纳米材料的表面官能团种类、表面电荷和比表面积等表面性

质的相关信息。

f）稳定性：主要包括金属纳米材料的分散性和金属离子的溶出。金属纳米材

料的分散性可借助DLS、Zeta电位仪、TEM等仪器测定其粒径和表面电位进行

判断。金属纳米材料溶出的金属离子可通过超滤、透析等手段与金属纳米材料分

离，借助ICP-MS、ICP-OES、AAS等仪器进行定量分析。

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4试验方法

4.1方法原理

本标准选用四膜虫（Tetrahymena）为受试生物（常见种类参见本标准附录A），

推荐使用嗜热四膜虫（Tetrahymenathermophila）、梨形四膜虫（Tetrahymena

pyriformis）等。四膜虫作为一类在水环境中广泛分布的原生动物，易于实验室培

养，是常见的模式生物。四膜虫可将其积累的颗粒消化，同时将未消化的部分排

出体外。

四膜虫生物富集试验主要分为吸收（暴露）阶段和排出（暴露后）阶段。在

吸收阶段，将指数生长后期的四膜虫暴露在含受试材料的培养基中，受试时间由

预试验确定。待四膜虫对金属纳米材料的富集达到一定量，将其与暴露介质分离

并重悬浮于不含受试材料的培养基中，进入排出阶段。两个阶段都需要在不同时

间点进行取样分析，根据四膜虫与培养基中受试材料含量或浓度计算吸收速率常

数（ku）、排出速率常数（ke）、生物富集系数（BCF）等参数。

4.2主要设备

主要设备如下：

——恒温培养箱；

——pH计；

——分析天平；

——纳米材料性质表征相关仪器（如，DLS、TEM）；

——常用玻璃器皿（如，锥形瓶）；

——细胞计数相关仪器（如，细胞计数仪）；

——离心机；

——样品消解相关仪器（如，烘箱、石墨消解仪）；

——受试材料浓度测定相关仪器（如，ICP-MS）。

4.3试验准备

4.3.1受试生物的准备

a）SPP培养基配制：SPP培养基可按本标准附录B.1的有关规定进行配制

并灭菌。

b）四膜虫的保种与复苏：具体步骤应符合本标准附录C的有关规定。

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c）四膜虫培养：将处于指数生长期的四膜虫（推荐细胞密度约为5×105个

/mL）按1:1000（v/v）接种至无菌SPP培养基中，用封口膜密封，于30℃±1℃

培养箱中培养至指数生长后期。

4.3.2受试材料的准备

试验培养基：为避免SPP培养基中复杂成分对材料稳定性造成影响，整个生

物富集试验在Dryl’s培养基（配方参见本标准附录B.2）中进行。预先配置Dryl’s

培养基并调节pH至6.9。

受试培养基配制：试验前应对受试材料进行物理化学性质表征，受试材料可

用超纯水配制成高浓度储备液并在适宜环境条件（如，2℃–8℃低温冷藏）下保

存备用。试验前用Dryl’s培养基稀释储备液，获得所需的受试培养基，受试培养

基应提前配制并过夜平衡。

注：受试材料储备液及受试培养基应为通过搅拌或/和超声配制而成的分散

悬浮液，尽量不用或慎用助溶剂、分散剂。

4.3.3预试验及试验条件设置

正式试验之前应进行预试验，以确定受试材料暴露浓度、吸收和排出阶段的

试验时间。

预试验应设置不少于4个暴露处理组以及空白对照组，受试材料暴露浓度范

围跨度应足够大，建议各处理组间使用10倍浓度差。其它试验条件应与四膜虫

培养过程保持一致。优化离心收集四膜虫细胞条件：在有效收集细胞的同时应避

免受试培养基中受试材料被收集。若无法有效分离细胞和受试培养基中受试材料，

可通过添加适量的助溶剂或分散剂增加受试材料的分散性以提高两者的分离效

果。

a）试验浓度确定：预试验应在0h、3h、6h、12h和24h对四膜虫进行计

数并利用光学显微镜观察其细胞形貌与游动速度，通过四膜虫密度变化计算处理

组与对照组四膜虫比生长速率（应按本标准附录D的方法计算）并结合四膜虫

细胞长宽比和游动速度，确定受试材料的无可观察效应浓度（NOEC）。后续正式

吸收试验受试材料的暴露浓度应低于受试材料对四膜虫的无可观察效应浓度。

b）试验时间：预试验也应间隔一定时间取样测定四膜虫对受试材料的富集

量，初步确定吸收趋于稳定（生物富集变化幅度在±20%）的时间。在吸收到达一

定量后可开始排出试验，排出试验也应间隔一定时间进行取样。排出阶段时间应

至少设置为四膜虫体内受试材料含量出现显著下降，如果排出速度过快或过慢可

根据情况改变排出阶段时间。

4.4试验步骤

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4.4.1正式试验

整个试验过程分为吸收和排出两个阶段，包括了三部分内容，具体如下：

a）吸收阶段：首先离心（1700g，10min）收集指数生长后期四膜虫并用Dryl’s

培养基清洗两次，随后将四膜虫悬浮于受试培养基中。受试培养基中四膜虫初始

密度为0.8–1×105个/mL，暴露时长应根据预试验结果确定。

b）排出阶段：吸收试验结束后，离心收集四膜虫并用含有1mmol/LEDTA

的Dryl’s培养基清洗两次以去除四膜虫表面弱吸附的受试材料，随后将四膜虫重

新悬浮于不含受试材料的Dryl’s培养基中，开始排出试验。排出阶段时间根据预

试验结果确定。

c）受试材料在生物体内的分布：在吸收阶段终点，收集四膜虫样品，根据

暴露的受试材料种类选择合适的制样方式对受试材料在四膜虫体内的分布进行

观察（如，使用TEM观察受试材料在细胞内的分布）。

4.4.2取样及样品制备

取样分为吸收和排出两个阶段的样品收集。吸收和排出阶段均需采集四膜虫

样品至少5次，采样时间点应均匀设置并包括起始和终止时间点。生物样本取样

方法为离心收集受试生物沉淀。同时，在初始和结束时刻采集含有四膜虫的受试

培养基以及生物样本离心后上清用以计算和评估试验过程中受试材料的质量平

衡，并监测所取样品中四膜虫细胞密度，计算生物富集相关参数。

样品应根据受试材料选择适宜的方法（如，硝酸/过氧化氢、王水、氢氟酸法

等）进行消解。

4.4.3样品测定

样品经消解后，应根据待测受试材料的类别和浓度选择合适的测定方法。常

见方法（如，ICP-MS、ICP-OES、AAS等）的测定范围可参考本标准附录E的

取值。

为了避免吸附等过程可能造成的损失，生物样品和水样采集后应尽快测定，

并计算吸收和排出速率常数等相关参数。若样品不能及时测定应采取合适的方法

进行保存。试验开始前应掌握保存特定样品的方法、明确贮存时间和提取方法等。

以ICP-MS对样品中金属含量测定为例进行说明：

a）校准曲线的绘制：仪器开启运行后，先使用调谐溶液调节仪器灵敏度、

信噪比等参数以满足检测要求，设定分析所需要的功率、气体流速、质谱测量方

式、积分时间等参数；根据待测金属类别选择相应的标准溶液，设置不同浓度梯

度，并加入相应的内标元素。使用内标法对标准溶液进行测定，根据标准溶液理

论浓度和实测信号值绘制校准曲线。

b）样品测定：样品消解后，根据需要用超纯水或稀酸进行稀释，记录稀释

倍数D。样品的最终酸度应与标准溶液一致并且不高于2%（v/v）。随后根据待

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测金属类别加入对应内标元素，使用ICP-MS测定样品中相应金属浓度，每隔10

个样品插入一个质量控制标准样品以确保测定数据的稳定性和可靠性。标准样品

的回收率应处于90%–110%之间，通过校准曲线计算待测元素质量浓度。

c）四膜虫对受试材料富集量的计算：若t时刻四膜虫富集受试材料的绝对

量为mt，四膜虫数量为nt，则t时刻四膜虫对受试材料的富集量Ct按下式计算：

mt

Ct=······························（1）

nt

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5数据处理

5.0.1生物富集系数（BCF）

퐶

BCF=푡······························（2）

퐶w

式中：Ct——某一时刻（t）四膜虫中受试材料的含量；

Cw——受试培养基中的受试材料浓度。

5.0.2吸收、排出速率常数（ku，ke）

大多数生物富集过程可用简单的二参数模型来描述。

在吸收阶段，四膜虫对金属纳米材料的富集可用以下公式表示：

퐶×푘

wu−(푘e+휇)×푡

퐶푡=×(1−e)+퐶ad·········（3）

푘e+휇

在排出阶段，四膜虫体内金属纳米材料含量可用如下公式表示：

−푘e×푡

퐶푡=퐶0×푒··················（4）

式中：ku——金属纳米材料的吸收速率常数；

ke——金属纳米材料的排出速率常数；

μ——四膜虫的比生长速率；

Cad——金属纳米材料在四膜虫细胞表面的吸附量，为吸收曲线在纵坐标

（生物富集量）上的截距；

C0——排出阶段0时刻四膜虫中受试材料的含量。

一般情况下如果通过一个方程同时估算ku和ke两个参数，它们之间会存在

显著相关性，因此建议首先从排出曲线（公式（4））计算出ke值，然后再用非线

性回归方法从吸收曲线（公式（3））计算ku值。

需要指出的是，如果吸收和排出曲线明显不符合公式（3）和（4），则应使

用更加合适的方法或模型进行计算。

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6质量控制

6.1受试材料试验浓度的设置

——受试材料浓度应低于受试材料对四膜虫的无可观察效应浓度；

——受试材料浓度宜尽量参考受试材料的真实环境浓度。

6.2试验过程中的质量控制

6.2.1试验中的质量控制

a）试验所用的四膜虫在SPP培养基中生长情况应符合典型的微生物生长曲

线。

b）试验温度应保持在30℃±1℃。

c）试验期间，四膜虫在试验培养基中生长正常，不应出现细胞密度显著下

降、四膜虫细胞明显破裂等不良现象。

d）试验中，四膜虫对受试材料的富集量加Dryl’s中的剩余量（即未被吸收

的部分）与受试材料的添加总量的百分比值应在90%–110%。

6.2.2检测过程中的质量控制

a）样品分析前应设置至少6个标准溶液浓度点（包括空白）来建立校准曲

线。校准曲线浓度范围跨度应控制在3个数量级以内，且拟合回归方程中决定系

数R2的值应不小于0.995。校准曲线应保证可重复性，每次检测都应重新测定、

绘制校准曲线。

b）试验时每批待测样品应附带空白样品、重复样品、加标回收样品。空白

样品检测值应与样品检出限相当。样品浓度应处于校准曲线范围内，推荐处于校

准曲线中部，样品浓度过低或过高时应浓缩或稀释后再进行测定。

c）受试样品定量分析时，应采用加标回收率的方法保证测试结果的准确性，

采用该方法时应保证受试材料加标回收率在80%–120%，加标量应为样品含量的

0.5倍–2.0倍，加标物形态应与受试材料相近，加标后总浓度不得超出检测方法

的检测范围。

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7试验报告

7.1受试材料和受试生物记录

试验报告必须包括以下记录资料。

7.1.1受试材料

形貌、粒径、化学成分、结构特征、表面性质、稳定性等。

7.1.2受试生物

学名、品系、来源、培养时间、培养条件（受试培养基等）、生长阶段、生

物量等。

7.2试验条件记录

以下试验条件应在本标准附录F表中进行详细记录。

（1）所进行的试验流程；

（2）四膜虫的培养条件：如，培养基、pH、温度、培养容器、接种密度和

接种体积等；

（3）试验设计：如，试验设计使用的容器规格大小、设计的平行数、每个

平行四膜虫接种密度、四膜虫吸收及排出受试材料的时间、四膜虫及受试培养基

取样频率及时间等；

（4）受试培养基储备液的配制方法及使用时的浓度等；

——储备液浓度、稀释溶液来源、试验暴露浓度及受试培养基特性（如，pH、

稳定性）等；

（5）四膜虫培养及暴露时的详细信息：如，细胞密度，光学显微镜下观察

到的细胞状态等；

（6）设定的试验暴露浓度、受试材料浓度的测定方法和数值（平均值、标

准偏差），受试材料的吸收/排出速率常数、生物富集系数和数值（平均值、标准

偏差）及其计算方法等；

（7）受试材料及受试生物的处理信息，包括详细的准备、储存条件等。

7.3试验现象记录

（1）试验期间金属纳米颗粒在培养基中的稳定性；

（2）四膜虫在试验期间的生长情况、异常现象。

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7.4结果与评价

7.4.1试验结果，应包含以下内容：

a）预试验得到的结果；

b）试验期间对照组和各暴露组四膜虫的细胞密度、观察到的四膜虫异常行

为（如，游动速度变缓、细胞变圆、细胞破裂等）；

c）记录试验时间、取样时间，所有取样时间的Ct（四膜虫中受试材料的含

量）和Cw（试验液中的受试材料浓度）值；

d）动力学参数（ku，ke等）和生物富集系数（BCF），如有可能，95%置信限

的吸收和排出速率常数，置信限和标准偏差，以及各受试材料浓度的计算和数据

分析方法；

e）试验中的任何异常情况、试验程序的调整及其他相关信息。

7.4.2试验结果的评价，应符合以下规定：

a）试验结果质量控制要求的符合情况；

b）根据生物富集系数（BCF）值的大小，应按本标准附录G的规定对金属

纳米材料的生物富集等级进行划分。

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附录A

（资料性附录）

推荐用于生物富集试验的四膜虫

推荐用于金属纳米材料生物富集试验的四膜虫见表A.1

表A.1推荐用于生物富集试验的四膜虫种类

物种学名

嗜热四膜虫Tetrahymenathermophila

梨形四膜虫Tetrahymenapyriformis

上海四膜虫Tetrahymenashanghaiensis

多色四膜虫Tetrahymenapigmentosa

热带四膜虫Tetrahymenatropicalis

柯式四膜虫Tetrahymenacorlissi

运动四膜虫Tetrahymenamobilis

北方四膜虫Tetrahymenaborealis

明布雷斯四膜虫Tetrahymenamimbres

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附录B

（资料性附录）

推荐用于四膜虫培养及试验的培养基

推荐用于培养四膜虫的SPP培养基见表B.1

表B.1SPP培养基配方

试剂浓度

蛋白胨2%w/w

酵母提取物0.1%w/w

FeCl30.33μmol/L

青霉素G100units/mL

硫酸链霉素100mg/L

两性霉素B0.025mg/L

推荐用于四膜虫富集金属纳米材料试验的Dryl’s培养基见表B.2

表B.2Dryl’s培养基配方

试剂浓度（mmol/L）

NaH2PO42.0

Na2HPO41.0

CaCl21.5

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附录C

(规范性附录)

推荐用于四膜虫保种与复苏的方法

C.1大豆保种（短期保存，半年左右）与复苏

a）保种：在无菌环境下将1mL状态良好的四膜虫接入制备好的大豆培养基

（将一颗黄豆放到装有10mL超纯水的试管中，于103kPa、120℃下灭菌20min

后，冷却至室温）中，再加入0.8mL无菌的矿物油，于30℃培养箱中静置培养。

b）复苏：在无菌环境下从保种四膜虫的大豆培养基中取1mL，将其转入到

盛有30mL的SPP培养基的锥形瓶内，置于摇床（30℃，135rpm）过夜培养，

用光学显微镜观察四膜虫活性。

C.2液氮保种（长期保存）与复苏

a）保种：取在SPP培养基中培养至密度为3×105个/mL的四膜虫，离心

（1000g，3min）去上清，用10mMTris-HCl（pH7.4）清洗2次并用SPP培养

基重悬浮，于30℃培养箱静置培养2–3天，再次离心将四膜虫浓缩至1mL，加

入二甲基亚砜冻存剂（终浓度为8%（v/v）），分装至冻存管内，室温静置30min

后放入−80℃冰箱18h–24h，再移至液氮中长期保存。

b）复苏：取出在液氮中保存的四膜虫细胞，于42℃下热激20s后缓慢加入

1mL42℃孵育的SPP培养基，融化后将其加入30mLSPP培养基中，于30℃条

件下培养，24h后用光学显微镜观察四膜虫活性。

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附录D

（资料性附录）

四膜虫比生长速率的计算

D.1四膜虫比生长速率的计算

比生长速率（μ）即测试期间，细胞密度自然对数值在单位时间内的变化率。

ln퐷−ln퐷

휇=푡0

푡

式中：μ——四膜虫的比生长速率；

Dt——t时刻的四膜虫细胞密度；

D0——0时刻的四膜虫细胞密度。

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附录E

（资料性附录）

推荐用于常见金属纳米材料所含金属的测定方法及其适用范围

推荐用于常见金属纳米材料所含金属的测定方法及其适用范围见表E.1

表E.1常见金属纳米材料所含金属的测定方法及其适用范围

检出限测定范围

分析方法元素

（μg/L）（μg/L）

Ag0.010.05–100

Al210–500

Au0.060.15–100

Cd0.050.2–100

电感耦合等离子体Ce0.010.05–100

质谱法Cu0.150.5–100

（ICP-MS）Fe1.55–1000

Mg0.31–1000

Mn0.050.2–100

Ti0.501.5–100

Zn0.100.5–100

Ag1030–5000

Al30100–5000

Au0.150.5–1000

Cd1030–2000

电感耦合等离子体Ce1030–2000

发射光谱法Cu30100–1000

（ICP-OES）Fe30100–50000

Mg1030–100000

Mn15–10000

Ti1030–5000

Zn30100–50000

火焰原子吸收分光Ag730–5000

光度法Al2291100–125000

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Au1.55–1000

Cd720–1000

Ce310–200

Cu310–10000

Fe1650–5000

Mg24–400

Mn930–10000

Ti6060–100000

Zn310–1000

Ag0.21–30

Al0.72–100

Au0.10.3–20

Cd0.21–7

Ce//

无火焰原子吸收分

Cu0.31–50

光光度法

Fe515–100

Mg0.030.1–3

Mn0.62–100

Ti6.520–500

Zn1.55–50

注：/表示无合适的参考数值。

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附录F

（资料性附录）

推荐用试验条件记录表

推荐用试验条件记录见表F.1

表F.1试验条件记录表

试验条件记录表

试验名称试验单位

试验地点试验日期

试验流程简介

受试材料及受

试生物处理

四膜虫培养基pH温度培养容器接种密度接种体积

培养条件

容器四膜虫吸收时间排出时间取样时间

平行数

试验设计规格接种密度监测监测频率

受试培养基储储备液试验暴露受试培养基特性

稀释溶液

备液及试验暴浓度浓度（pH、稳定性等）

露浓度

四膜虫镜检细吸收速率排出速率生物富集相关参数

四膜虫暴露及

密度胞状态常数常数系数计算方法

参数计算

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附录G

（资料性附录）

推荐用金属纳米材料生物富集等级划分表

推荐用金属纳米材料生物富集等级划分表见表G.