分子印迹电化学传感器对15-AG的检测研究

TOC\o"1-4"\h\u目录TOC\o"1-3"\h\u12511引言 摘要：1,5-脱水-D-葡萄糖醇（1,5-AG）是一种具有吡喃环结构的六碳单糖，分子结构与葡萄糖十分相似。1,5-AG是一个与糖代谢密切相关的指标，在肾小管重吸收，但这种重吸收可以被葡萄糖竞争性抑制，因此糖尿病人的血浆1,5-AG显著低于健康人。本实验制备以1,5-AG为模板分子，苯胺作为功能单体的一种新型灵敏检测的1,5-AG分子印迹传感器。通过循环伏安法（CV）和电化学阻抗（EIS）等手段对分子印迹聚合物进行表征和性能评价，同时优化模板分子和功能单体的摩尔比、聚合时间、电聚合圈数、洗脱时间、检测体系的pH、扫描速率对分子印记传感器响应的影响。在最佳条件下，制备出高灵敏度的1,5-AG分子印迹电化学传感器，检测范围为0.5μM~10μM，检测限为0.178μM。关键词:分子印迹；1,5-脱水-D-葡萄糖醇；电化学传感器1引言糖尿病是影响人类健康的代谢性疾病之一，其会引发多种代谢紊乱和并发症，如高血糖、高血酯等REF_Ref1810\w\h[1]，早期的诊断和治疗对糖尿病患者是非常重要的，而1,5-AG能够准确检测出糖尿病患者过去3-7天的平均血糖水平，反映糖尿病近期发展状况的标志物REF_Ref1993\w\h[2]。1,5-AG是一种天然存在的1-脱氧形式的葡萄糖类似物具有封闭的环结构，具有较好的代谢稳定性REF_Ref2147\w\h[3]。因此，1,5-AG在疾病检测方面有着重要的应用价值，为疾病的诊断治疗提供重要依据和手段。目前，质谱法(MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)等方法可以检测1,5-AGREF_Ref2362\w\h[4-REF_Ref2369\w\h5]。质谱能够对分析的样品进行可靠和准确的检测，并且不干扰基质，是一种有效分析1,5-AG的方法，常常被用于动物或者人类血糖的鉴定REF_Ref2245\w\h[6]。ELISA具有较高的特异性和选择性，能够利用抗原和抗原连接物之间的竞争来检测1,5-AG，但ELISA试剂盒价格较为昂贵REF_Ref2529\w\h[7]。HPLC具有色谱柱可重复使用、易于回收的优点，但存在“离柱效应”的缺点REF_Ref2548\w\h[8]。这些方法灵敏度高，特异度高，但存在耗时、昂贵、步骤复杂等缺点，无法实现廉价、广泛、实时的监测。为了克服这些缺点，开发了一系列1,5-AG电化学传感器。如Adamson等REF_Ref2591\w\h[9]以吡喃糖氧化酶(pyranoseoxidase,PROD)为识别元件对金电极作为工作电极进行修饰，得到了电化学阻抗谱。Odaci等REF_Ref2636\w\h[10]开发了一种基于碳纳米管(CNT)固定的碳糊电极的1,5-AG传感器，实现了对葡萄糖的高灵敏度检测。分子印迹技术的基本原理是在交联剂的作用下，将模板分子与功能单体通过共价或者非共价作用在聚合物溶液中进行聚合，得到分子印迹聚合物。在用合适的洗脱液除去模板分子，以便在聚合物网络结构留下与模板分子结构相一致的立体孔穴，这种孔穴可以对印迹分子进行高度的特异性识别REF_Ref2692\w\h[11]。电化学传感器具有检测灵敏度高、检测速度快、操作简单快捷等特点，将目标分子浓度信号转换为电化学信号REF_Ref2754\w\h[12]。分子印迹电化学传感器兼具分子印迹技术的预定性和特定识别性与电化学技术的检测高灵敏度、操作简单快捷等特点REF_Ref2777\w\h[13]，使得分子印迹传感器在食品安全REF_Ref2832\w\h[14]、生物医药REF_Ref2907\w\h[15]、环境检测REF_Ref2934\w\h[16]等领域获得了广泛应用。本实验以苯胺为功能单体，1,5-AG为模板分子，在聚合液下，通过分子的相互作用力形成分子印迹膜（MIPs），用乙酸：水为1：9的洗脱液洗脱模板分子，留下与模板分子结构相一致的立体孔穴，最后用吸附液吸附模板分子检测其性能。通过循环伏安法（CV）和电化学阻抗（EIS）等方法对分子印迹聚合物进行表征和性能评价，优化模板分子和功能单体的摩尔比、电聚合圈数、洗脱时间、吸附时间、检测体系的pH、扫描速率对分子印迹传感器电化学响应的影响。2实验部分2.1仪器和试剂表1实验仪器所需仪器名称生产厂家电化学工作站CHI660E上海辰华仪器有限公司电子分析天平北京赛多利斯科学仪器有限公司超声波清洗机广州邦洁电子产品有限公司pH计上海仪电科学仪器股份有限公司铂电极（GCE）武汉高仕睿联科技有限公司Ag/AgCl电极武汉高仕睿联科技有限公司铂丝电极武汉高仕睿联科技有限公司表2实验试剂所需试剂符号表示生产厂家1，5-AGC6H12O5阿达玛斯（Adamas）苯胺C6H7N上海阿拉丁生化科技有限公司乙酸CH3COOH西陇化工股份有限公司氯化钾铁氰化钾无水乙醇KClK3[Fe(CN)6]CH3CH2OH广州化学试剂分公司西陇化工股份有限公司广州化学试剂厂氢氧化钠NaOH广州化学试剂分公司磷酸磷酸二氢钠磷酸氢二钠超纯水H3PO4NaH2PO4Na2HPO4H2O广州化学试剂分公司广州化学试剂厂广州化学试剂厂实验室自制2.2样品的制备2.2.1溶液配制不同浓度的PBS缓冲液：用磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾按一定的比例分别配制出pH=4、5、6、7、7.5、8的0.1MPBS缓冲溶液。聚合溶液：利用10mLPBS缓冲液，配制浓度为10mM的苯胺单体和2mM1,5-AG模板分子。洗脱液：乙酸和水按9：1的比例配制出洗脱液。标准溶液：使用PBS溶液（pH=70.1M）配制不同浓度的标准溶液。2.3实验方法2.3.1GCE电极预处理用0.05μm的三氧化二铝粉末在仿麂皮上将电极抛光，分别用去离子水、无水乙醇溶液和去离子水对GCE电极依次进行超声清洗5min，将预处理的电极放入5mMol/L的铁氰化钾溶液中进行CV扫描(电位窗口为-0.2V-0.6V)，当氧化还原峰电位小于100mV时，则GCE电极预处理完毕。2.3.2分子印迹膜的制备将GCE电极放在三电极系统电化学工作站的电压参数为-0.2-0.9V的范围内进行CV扫描速度为50mV/s，扫描圈数为8圈，在电极表面形成分子印迹膜。聚合完成后在洗脱液浸泡20min洗脱1，5-AG模板分子后用去离子水水冲洗。非印迹膜的制备方法同上，在制备过程中不需加入模板分子。图（A）为含有1，5-AG模板分子电聚合的CV图。图（B）为没有1，5-AG模板分子电聚合的CV图。由图（A）可知随着电聚合圈数的增加电流在急剧下降后循环圈数达到8圈时电流逐渐减小并最终趋于零。原因在于含有1，5-AG的聚合液中，成功在电极表面中形成一层分子印迹薄膜。这层薄膜不导电，能够阻碍探针溶液和电极电子转移。结果表明电极表面聚合上了分子印迹薄膜。图1分子印迹薄膜A和非分子印迹薄膜B的循环伏安电化学聚合图2.4传感器的检测过程将制备的传感器放入含有1,5-AG标准溶液的溶液中吸附15min，让传感器表面的分子印迹聚合物薄膜与1,5-AG分子进行充分的相互作用，吸附完成后，在5mMol的铁氰化钾溶液中，采用差分脉冲伏安法(DPV)扫描，由于传感器表面已经吸附了1,5-AG分子，这些分子与铁氰化钾溶液中的离子或电子传递过程发生相互作用，导致电流的变化，记录下各个阶段的峰值电流，反映出传感器在不同条件下的电化学响应，以ΔI作为评价指标，可以评估传感器的灵敏度。2.5实验条件的优化2.5.1扫描速率的优化扫描速率在分子印迹膜的生长过程中起着至关重要的作用，影响着膜的生长速率和最终的形貌特征。在实验中，选择了五个不同的扫描速率（25、50、75、100和125mV/s）来聚合印迹膜，将聚合后的GCE电极放入吸附液中吸附20min。吸附完成后，用5mMol/L的铁氰化钾溶液在电化学工作站中进行循环伏安（CV）扫描。在CV扫描过程中，记录下各个阶段的峰值电流，并计算ΔI，即吸附前后峰值电流的变化量。ΔI作为评价指标，能够反映传感器对目标分子的响应程度，选择最佳扫描速率。2.5.2扫描圈数的优化印迹膜的沉积厚度是分子印迹传感器制备过程中的一个关键参数，可以通过调整扫描圈数来控制。沉积厚度的变化会直接影响电子在印迹膜与电极之间的转移效率，进而影响到传感器的性能。因此本实验设定的扫描圈数分别为6、7、8、9、10圈，每个扫描圈数都会对应一个特定的沉积厚度，从而影响到传感器的电化学响应。聚合分子印迹膜后，同上步骤，以ΔI为评价指标，存在一个最佳的扫描圈数，使得ΔI达到最大值。2.5.3聚合底液功能单体和模板分子摩尔比例的优化分子印迹膜的印迹位点的数目和结构是受聚合液中功能单体与模板分子的摩尔比例影响，根据分子量来计算不同摩尔比例下功能单体和1,5-AG的质量比例。在实验中，设定了10：1、10：2、10：3、10：4、10：5的摩尔比例进行优化。通过调整聚合液中功能单体与1,5-AG的摩尔比例，并比较不同比例下ΔI的大小，选择最佳的摩尔比例值，优化分子印迹传感器的性能。2.5.4聚合底液pH的优化聚合底液的pH值是影响分子印迹膜形成的关键因素之一，它提供了质子环境，对电聚合过程中分子印迹膜的结构和性能产生重要影响。为了优化pH值，本实验选择了五个不同的pH值（5、6、7、7.5、8）进行探究。在每个pH值下，制备相应的聚合底液，并进行电聚合反应以形成分子印迹膜，按照相同的后续步骤处理传感器，包括静态吸附和循环伏安扫描。在每次实验中，我们记录下ΔI值，以评估不同pH值下传感器的性能。2.5.5洗脱时间的优化洗脱时间对于分子印迹传感器的制备过程至关重要，它决定了模板分子被完全洗脱的程度。为了优化洗脱时间，本实验选择了五个不同的时间点：2min、4min、6min、8min和10min来进行探究。通过比较不同洗脱时间下传感器的ΔI值，可以判断哪个洗脱时间下传感器的性能最佳。2.5.6吸附时间的优化吸附时间对分子印迹传感器的性能具有重要影响，它决定了模板分子对分子印迹的空腔再次特异性吸附结合的程度，本实验选择五个不同的时间点：5min、10min、15min、20min、25min进行优化，记录下ΔI的值，选择最佳的吸附时间。2.6性能测试2.6.1线性范围和检出限配制浓度的分别为0.5、1、2、4、6、8、10μmol/L的1，5-AG标准溶液，用不同浓度的1,5-AG标准溶液吸附最优条件下制备的MIPs传感器，使用5mMol/L的铁氰化钾溶液扫描DPV(电位窗口为-0.2-0.6V,扫速为50mV/s)，记录峰电流和ΔI值，将1,5-AG浓度与ΔI值进行线性拟合，计算出MIPs传感器对1,5-AG的检出限。3结果与分析3.1可行性验证3.1.1循环伏安法（CV）表征采用CV(电位窗口为-0.2-0.6V,扫速为50mV/s)考察了不同电极在含5.0mmol/L铁氰化钾溶液中的电化学行为。如图2所示，MIP/NIP线表示有模板分子和无模板分子聚合的CV图，MIP-adsorbed线表示聚合物吸附图，MIP-washed表示聚合物洗脱图，NIP-washed则表示无模板分子洗脱图。有模板分子和无模板分子聚合后，都没有形成电流峰。MIP-washed曲线出现铁氰化钾溶液的电流峰，表明在模板分子存在的情况下，聚合形成了与模板分子相匹配的孔穴。用洗脱液洗脱出模板分子后，暴露的孔穴使铁氰化钾分子到达电极表面，产生电化学响应，从而出现氧化还原电流峰。将洗脱1,5-AG模板分子的GCE电极放在吸附液溶液中孵育20min，铁氰化钾溶液的峰电流下降。最后，与印迹电极相比，非印迹电极（NIP）的曲线显示很弱的电流响应，这是因为NIP膜上缺乏与模板分子相匹配的印迹孔穴，铁氰化钾分子无法有效地到达电极表面进行电化学反应。图2不同电极的CV图3.1.2EIS表征从图3可见，MIP/NIP曲线表示有模板分子和无模板分子聚合的EIS图，说明电极表面聚合后，出现了不导电的聚合膜，减少了溶液和电极表面电子的传递，电阻增大。MIP-washed曲线表示聚合物洗脱图和NIP-washed曲线则表示无模板分子洗脱图，表明用洗脱液洗脱1,5-AG模板分子，电极表面留下的孔穴能够形成电子转移的通道，导电性增强，电阻会显著减小。MIP-adsorbed曲线表示聚合物吸附图，当印迹电极再次吸附模板分子后，部分印迹孔穴会被重新占据，导致扩散通道被堵塞，这减少了铁氰化钾分子到达电极表面的机会，也降低了电子传递的效率，电阻会明显增大。图3不同电极的EIS图3.2传感器的构建实验优化3.2.1MIPs扫描速率的优化扫描速率影响了电极表面的电化学反应速率，决定了电位发生变化的快慢。从图4中，可以发现随着扫描速率的增大，ΔI呈现上升趋势，表明在一定范围内，增加扫描速率可以促进分子印迹膜在电极表面的生成，从而提高传感器的响应。当扫描速率达到50mV/s时，ΔI达到最大值，超过50mV/s后电流值下降，这是因为过快的扫描速率，形成分子印迹膜表面不均匀，影响电子的传递效率，降低了传感器的性能。因此，虽然较快的扫描速率可以加速膜的生成，但过高的速率并不利于形成高质量的分子印迹膜。综上所述，50mV/s被确定为膜在电极表面CV电聚合MIPs的最佳扫描速率。在这个速率下，可以获得均匀分布的分子印迹膜，从而获得最佳的传感器性能。图4扫描速率对峰电流的影响3.2.2扫描圈数的优化膜的厚度对电极的电流响应和传感器的性能有重要影响。在制备过程中，通过循环伏安扫描在电极表面沉积分子印迹膜。扫描圈数越多，电极表面的膜就越厚。然而，膜的厚度并不是越厚越好。过厚的膜会降低电子的传递效率。这是因为电子在通过较厚的膜时需要穿越更多的障碍，导致电阻增加，电流响应下降。过薄的膜虽然电子传递效率高，但印迹位点数量可能不足，从而影响传感器的灵敏度。印迹位点是识别目标分子的关键，数量不足会导致识别能力下降。从图5中，我们可以看到随着扫描圈数的增加，ΔI（电流变化量）呈现先上升后下降的模式。当扫描圈数大于8时，膜过厚导致电子传递效率降低，从而使ΔI下降。因此，为了获得最佳的传感器性能，需要找到一个合适的扫描圈数，使得分子印迹膜的厚度既能保证足够的印迹位点数量，又能保持较高的电子传递效率。因此，需要通过控制扫描圈数来优化膜的厚度，以实现最佳的电流响应和灵敏度，扫描圈数为8为最佳值。图5扫描圈数对峰电流的影响3.2.3聚合液功能单体和模板分子摩尔比例的优化在本实验中，聚合液中苯胺溶液与1,5-AG溶液的摩尔比例对分子印迹膜的印迹位点数目和结构的影响。聚合液中的苯胺溶液与1,5-AG溶液通过相互作用力进行结合，这些作用力包括氢键、π-π堆积等，图6中可以观察到响应电流ΔI达到最大值，苯胺单体与1,5-AG模板分子的摩尔比例为10：2。这说明在这个比例下，苯胺单体与1,5-AG模板分子的结合最为紧密，形成的印迹位点数量最多且结构最为稳定。因此，此时的电聚合效果最好，传感器的灵敏度也最高摩尔比例过大或过小，都会导致结合不够紧密。比例过大时，苯胺单体可能过量，无法与1,5-AG模板分子充分结合，导致印迹位点数量减少；比例过小时，1,5-AG模板分子可能无法被足够的苯胺单体包围，同样会影响印迹位点的形成。这两种情况都会导致电聚合效果变差，进而影响传感器的灵敏度。图6分子摩尔比对峰电流的影响3.2.4聚合底液pH的优化图7表示不同聚合底液pH在聚合后和吸附后的峰电流值以及响应电流ΔI的变化情况。聚合底液pH不能太高也不能太低，会影响质子环境。当pH过低时，底液会则提供过多的酸性条件，pH过高时，聚合底液提供过多的碱性条件，会阻碍1,5-AG中电负性大原子与苯胺单体中H原子的结合，最终影响印迹位点的数目。所以，pH=6时的响应电流ΔI为最大，选择pH=6作为电聚合底液的最佳pH值。图7pH对峰电流的影响3.2.5MIPs洗脱时间模板分子的清除对于印迹位点的形成和暴露具有直接影响，进而决定了传感器的响应电流ΔI值。如图8所示，表示分子印迹聚合物（MIPs）洗脱时间与响应电流ΔI值之间关系。随着洗脱时间增加，响应电流ΔI值在12min时最大后呈现下降趋势，说明12min形成的分子印迹位点最多;当洗脱时间小于12min时，响应电流ΔI值较小。这可能是因为在这个时间段内，分子印迹位点还没有完全形成或暴露出来。模板分子与功能单体之间的相互作用需要一定的时间来达到平衡，从而形成稳定且有效的印迹位点。洗脱时间超过12min时，响应电流ΔI值也开始下降。这是由于过长的洗脱时间导致印迹位点受到破坏或失去稳定性。长时间的洗脱可能破坏了印迹位点与功能单体之间的相互作用，使得印迹位点失去识别模板分子的能力。因此，最佳洗脱时间为12min。图8洗脱时间对峰电流的影响3.2.6吸附时间的优化吸附时间是影响传感器的检测性能的决定性因素，不同的吸附时间对电极表面电流有不同的影响。如图9所示，吸附时间越长，峰值响应电流就越小，ΔI值越大，综合实验时间效率，吸附时间达到15min最佳吸附时间。图9吸附时间对峰电流的影响3.3传感性能研究3.3.1传感器的线性范围与检出限配制浓度的分别为0.5、1、2、4、6、8、10μmol/L的1，5-AG标准溶液，用其1,5-AG标准溶液吸附最优条件下制备的MIPs传感器，在5mMol/L的铁氰化钾溶液扫描DPV(电位窗口为-0.2-0.6V,扫速为50mV/s)，其DPV曲线如图10(A)所示。峰电流随着1,5-AG标准浓度的增加，传感器的峰电流随着浓度的升高的降低。如图10(B)所示，其线性关系可表示为y=4.104x-0.2881,R2=0.9986,线性范围为0.5-10μmol，1,5-AG的检出限为0.178μmol。图10分子印迹传感器在不同浓度的1,5-AG溶液中的测量结果A和分子印迹传感器的标准工作曲线B4结论本文以1,5-AG为载体，结合苯胺功能单体制备的印迹膜,构建了一种用于检测1,5-AG分子印迹电化学传感器。传感器的线性范围为0.5-10μmol,检出限低至0.178μmol。所构建的传感器对1,5-AG具有高灵敏度检测，为实际样品检测提供了一种简单、经济、有效的分析,对糖尿病治疗有很大的应用潜力。

参考文献李雪艳,廖经忠,黄康康等.血清1,5-AG在2型糖尿病早期诊断中的应用价值[J].现代医学,2023,51(09):1220-1226.LiGuiyin,WuGuangxiong,HuangJindan,WangBo,LiHaiMei,ChenWei,LiangJintao,TanMingxiong,ZhouZhide,Nanozyme-mediatedcascadereactionsystemforelectrochemicaldetectionof1,5-anhydroglucitol[J].Bioelectrochemistry,2022,147:108204.朱华甦.1，5-AG在儿童急性B淋巴细胞白血病进展中的作用及机制研究[D].山东大学,2024.LiangJ,YanK,LiuY,etal.ArGO-PAM-Fc/AuNPsnanosensingmembraneinalight-addressablepotentiometricbiosensorfor1,5-anhydroglucitoldetermination[J].MicrochemicalJournal,2023,184:108185.LiG,WuG,HuangJ,etal.Nanozyme-mediatedcascadereactionsystemforelectrochemicaldetectionof1,5-anhydroglucitol[J].Bioelectrochemistry,2022,147:108204.Palau-RodriguezM.,Garcia-AloyM.,MinarroA.,Bernal-LopezM.R.,BruniusC.,R.,Gomez-HuelgasR.Landberg,F.J.Tinahones,C.Andres-Lacueva,Effectsofalong-termlifestyleinterventiononmetabolicallyhealthywomenwithobesity:Metaboliteprofilesaccordingtoweightlossresponse,Clin.Nutr.2020,19:215-224.AksornJ.,TeepooS.,Developmentofthesimultaneouscolorimetricenzymaticdetectionofsucrose,fructoseandglucoseusingamicrofluidicpaper-basedanalyticaldevice,Talanta2020,207: