防晒剂和重金属对海洋微藻的复合毒性机制研究

摘要：随着人们防晒需求的增加，大量的有机防晒剂释放到周围水体中造成污染。同时，有机防晒剂极易吸附重金属等污染物，从而影响海洋中微藻的生长。然而，有机防晒剂与重金属对海洋微藻的复合毒性机制却尚不明确。本研究选取四种常用有机防晒剂：对甲氧基肉桂酸辛酯(octylmethoxycinamate，OMC)、4-甲基苄亚基樟脑(4-methylbenzylidenecamphor,4-MBC)、水杨酸-2-乙基己酯(2-ethylhexylsalicylate，EHS)、二苯甲酮-3(Benzophenone-3,BP-3)，在含有重金属的海水中对小球藻进行5天的胁迫处理，探究有机防晒剂和重金属对海水小球藻(Chlorellapacifica)生长的抑制作用，观察其细胞形态并测定胞外产物的可溶性总有机碳（DOC）。研究发现：四种有机防晒剂对海洋微藻的生长有显著的抑制作用。而重金属存在的情况下，有机防晒剂对海水小球藻的毒性减弱，其胞外产物的含量也降低，说明重金属有助于降低有机防晒剂的毒性作用，减弱海洋微藻的应激反应。本研究有助于科学评估防晒剂与重金属两种污染物对海洋生态系统的影响，能够为修复海洋生态环境提供重要的基础数据。关键词：防晒剂；海水小球藻；胞外聚合物；重金属1.绪论1.1研究背景1.1.1海水小球藻（Chlorellapacifica）1.1.1.2海水小球藻的意义海洋微藻有着种类较多，繁殖较快的特点，同时在物质循环和能量流动中发挥重要作用[1]。它们作为海洋水生系统中整个食物链食物网的基础成分之一，在维持海洋生态系统平衡稳定及生态系统重要元素循环的过程中扮演着十分重要的角色。小球藻是一种广泛分布在水体中的单细胞绿藻[2]。既能进行光能自养，也能利用有机碳源生长、繁殖，实现短时间内的高速增长，因此应用价值很高。例如在工业领域，小球藻能作为生物吸附剂处理废水中的有机、无机污染物及重金属，是废水资源化利用的一个重要助力[3]。本研究拟采用海水小球藻（Chlorellapacifica）作为实验物种，海水小球藻是一种普生性单细胞藻[4]，直径5-10μm，是地球上起源很早，分布广泛，生长周期短，繁殖速度快，故容易培养，同时对环境变化敏感，是一种常用来进行环境检测的模式生物。1.1.1.2海洋微藻的胞外产物在生长过程中，海洋微藻往往会释放多种代谢产物，包括碳水化合物、氨基酸、酶、脂类、维生素、有机磷酸以及抑制和促进因子等，我们将其统称为胞外产物（Extracellularproducts,ECP），它们是海水中化学物质的关键来源之一[5]。ECP在海洋生态系统中作用甚广[6]。它不仅能够通过菌藻互作，促进微生物群落的建立，参与营养循环，还能影响到海洋生物的摄食行为。在面临海洋环境中日益增多的污染物时，ECP更是发挥了极为重要的保护功能，那就是作为污染物接触细胞的第一道屏障，在一定程度上对常规污染物的毒性效应进行抑制，保护海洋生态系统，维持稳态[7]。研究还表明，通过生物吸附，EPS在藻类抵御污染时可以作为藻类应激的重要一环，减缓有毒物质的毒害作用[8]。一方面，能够显著影响藻类团聚体的理化性质，保护细胞免受脱水等。另一方面，EPS还能作为碳库，响应环境变化，为微藻的生长和适应提供必要的支持。综上所述，EPS作为海洋微藻胞外产物的重要组成，在海洋生态系统中具有多重功能，对维持海洋生态系统的稳态具有重要意义。1.1.2防晒剂污染1.1.2.1防晒剂防晒剂由于能保护人类皮肤免受紫外线伤害的特性，正被广泛应用于个人护理产品中。其中有机紫外防晒剂(OrganicUVfilters)可吸收紫外线，用途更广,常用的有机紫外防晒剂包括肉桂酸类、二苯甲酮类、樟脑衍生物类、水杨酸类等[9]。本研究拟选取四种用量较大，且具有一定环境毒性的有机紫外防晒剂：对甲氧基肉桂酸辛酯（OMC）、二苯甲酮-3（BP-3）、4-甲基苄亚基樟脑（4-MBC）以及水杨酸-2-乙基己基酯（EHS），进行小球藻毒性试验。1.1.2.1防晒剂的致毒效应近年来，有机紫外防晒剂的污染问题日渐严重，在多处水体中被频繁检出，对水生生态系统安全构成严重威胁。这类新兴的环境污染物通过多种途径进入水生环境，其中游泳等娱乐活动的直接输入和废水处理厂的间接输入是两大主要来源。由于有机紫外防晒剂的高度亲脂性，它们容易在生物体中富集起来[10]。目前已有多个研究着眼于有机紫外防晒剂污染对水生生物造成的负面影响[11]。有机防晒剂是会对海洋微藻的生长和光合作用产生负面影响的。这些化合物通过抑制微藻的光合作用，进一步影响它们的生长和繁殖。例如，BP-3会导致藻类体内光合作用色素减少，之后进一步影响藻类植物光合作用，导致其生长速度下降。研究表明，BP-3能还够抑制莱茵衣藻(C.reinhardtii)的生长速率和一些酶的活性，影响线粒体功能、诱导活性氧的生成[10]。除了直接的影响外，有机防晒剂还可能通过影响海洋微藻的胞外产物来间接影响生态系统。研究发现，暴露于防晒剂的微藻胞外多糖、蛋白质等胞外产物的组成和量会发生变化。这些变化作用于微藻与微生物群落的相互作用来影响海洋生态系统的功能[12]。1.1.3重金属污染1.1.3.1重金属重金属，作为地壳中的自然元素，其在水环境中的含量因人类活动的增加而显著上升。水生环境中的重金属主要来源于工业废水。这些重金属具有难降解和易转化的特性，一旦进入水生系统，便容易被生物体吸收并积累，沿着食物链富集，对生物健康造成严重威胁[13]。1.1.3.2重金属对藻类的致毒效应藻类对重金属较为敏感，会引发多个方面的毒性效应。首先，重金属会干扰藻类的生长代谢，导致细胞色素减少、细胞结构畸变[14]。此外，重金属还会与酶结合，改变其结构，从而影响酶的活性，进一步加剧对藻类生理功能的损害。这些变化不但影响了藻类的正常生理功能，还可能影响其在水生生态系统中的生态功能。重金属种类不同，对藻类的影响也有差异。例如，Cd是即使在低浓度下也能对藻类产生较为明显的毒性效应。而Cu和Zn是藻类生长所必需的微量元素，一般在高浓度下才会对藻类产生毒害作用[14]。值得注意的是，微藻通过其分泌的胞外产物对重金属离子进行吸附[15]。胞外产物中多种基团与重金属离子形成共价键，使重金属在细胞表面发生聚集。这种生物吸附过程不需要消耗能量，在死亡的藻细胞中也能发生。重金属对藻类的具体作用机制和生态效应已有部分研究，本实验主要聚焦于防晒剂与重金属共同的毒性效应，但并未进行重金属定量处理，而是将其作为变量。1.2研究意义有机防晒剂作为新兴的海洋污染物，其对海洋生态系统的潜在影响尚未了解完全。尽管已经有一些关于有机防晒剂对海洋微藻的影响机制研究，但仍然存在许多未知领域。需要更深入地探讨有机防晒剂对海洋生态系统的影响，以及如何通过减少其危害或开发更环保的替代品来降低这些风险。微藻在海洋生态系统中扮演着多种角色，包括促进微生物群落的建立、参与营养循环、影响海洋生物的摄食行为等。同时微藻参与着海洋中的元素循环。有机防晒剂可能通过改变胞外产物的组成和量，间接影响元素循环。有机防晒剂可能通过改变微藻的生理状态和代谢活动，影响微生物群落结构，进而影响海洋生物多样性。此外，有机防晒剂与重金属两种污染物的复合毒性研究还存在空白，了解二者对海洋生态系统的影响可以为污染治理提供科学依据。综上所述，研究有机防晒剂与重金属对海洋微藻的影响，不仅对于理解海洋生态系统具有科学价值，而且对于指导环境保护的实践、促进海洋环境可持续发展具有重要的实际意义。2材料与方法2.1实验材料与试剂本实验所用的海水小球藻由上海光语生物科技有限公司所提供。使用的海水来自于中国海南省文昌市铺前镇周围海岸。所有有机防晒剂均使用二甲基亚砜（DMSO）增溶。表1海水培养基（F/2培养基）Tab.1seawatermedium(F/2medium)营养盐化学药品母液含量氮NaNO375g/L磷NaH2PO4·2H2O5.62g/L硅NaSi2O3·9H2O30g/L微量1Na2EDTA4.36g/LFeCl3·6H2O3.15g/L微量2CuSO4·5H2O0.0098g/LZnSO4·7H2O0.022g/LCoCl2·6H2O0.01g/LMnCl2·4H2O0.18g/L维生素1VitaminB10.1g/L维生素2VitaminB120.0005g/LVitaminH0.0005g/L表2设备与仪器Tab.2equipmentandinstruments仪器名称型号厂家智能人工气候箱HP250GS瑞华仪器设备有限责任公司超纯水机UPR-II-10TNZ优普超纯科技有限公司紫外分光光度计SP-756P普析通用仪器有限责任公司光学显微镜BA210奥林巴斯（中国）有限公司离心机TDZ5-WS湘仪实验室仪器开发有限公司电子天平/Mettler,瑞士微孔滤膜GF/FWhatman，英国总有机碳分析仪TOC-L-CPN岛津仪器（苏州）有限公司隔膜真空泵GM-0.5A津腾实验设备有限公司盐度计LS10T广州速为电子科技有限公司立式自动压力蒸汽灭菌器GR85DA美国ZEALWAY仪器股份有限公司2.2藻种扩培2.2.1接种1.接种海洋小球藻前所有实验用具和培养基需经过高温高压灭菌处理，用F/2培养基作为营养源来培养海水小球藻。海水需以滤膜(孔径0.22μm)过滤。2.将培养基倒入干净的250mL的锥形瓶，用透气封口膜封住瓶口。置于高压灭菌锅中进行121℃，30分钟的高压灭菌，室温冷却。3.在无菌操作台上进行小球藻接种，接种密度约为5×10⁶cells/mL，置于人工气候箱中培养。为贴近自然环境，将人工气候箱光暗周期比设置为9ｈ：15ｈ，光照强度为6000lux，温度（25±0.1）°Ｃ，每天定时人工摇瓶1次，以防止小球藻附壁或下沉。2.2.2培养培养十天后，进行再次转接，扩大培养，以保证每组实验组的藻种都能够同批等量供应。在扩大培养小球藻的过程中，我们发现初接种的1~5天内，藻密度呈现缓慢增加的趋势，这一阶段称作延缓期，即小球藻对培养环境的适应阶段；接种第6天后，小球藻的密度呈现指数型增加，此时为小球藻的对数生长期，小球藻的生物量也在迅速增加，这一阶段的小球藻可作为实验微藻；在第13天之后，小球藻的密度增长变得缓慢且趋于平缓，此阶段为小球藻生长的稳定期，小球藻的活性和对环境变化的敏感性都有所降低，不适应实验所需。故本次实验选用第6天至第13天的小球藻进行后续实验[16]。2.3防晒剂与重金属对小球藻的抑制效应将藻液接种到F/2培养液中，混匀，使初始藻密度约为5×10⁶cells/mL，然后将混匀后的藻液分装到250mL锥形瓶中，每瓶加入250mL藻液，将一组加入75μL二甲基亚砜（DMSO）做对照组，处理组分别加入75μL的300μg/LBP-3、4-MBC、EHS、OMC的DMSO溶液，混匀。其培养条件同2.2培养，每组各设置3个平行实验，实验持续5天，于第5天进行取样分析。2.3.1藻细胞密度的测定分别于第一天和第五天取10mL样品,摇匀取出0.1μL，用血细胞计数板鉴定藻细胞密度，血细胞计数板为25×16型。取计数室四角、中央中方格进行计数，若有细胞压在方格界限上，应当计右方和上方两边及其夹角上的细胞数。为确保计数准确性，需要避免某一方格内细胞数过多,应当对样液进行适当稀释。还需要避免细胞分布不均,必须要把样液摇匀后进行计数[17]。计算公式如下：小球藻生物量（细胞数）/mL=每个小方格的细胞平均数×400×10000×稀释倍数。2.3.2细胞密度抑制率计算公式如下：细胞密度抑制率（%）=[（对照组细胞密度−处理组细胞密度）/对照组细胞密度]×100%2.3.3小球藻细胞形态的观察使用普通光学显微镜观察生长5d的海水小球藻形态。首先将生长5d的藻液摇匀，取1~2滴藻液滴到载玻片，沿边缘小心盖上盖玻片，防止气泡产生影响观察。将制片后的载玻片放在显微镜物镜下，观察细胞形态。2.4防晒剂与重金属对小球藻胞外产物的影响取分析纯邻苯二甲酸氢钾（KHP）置于105-120°C温度下1h，去除其中的水分，随后精确称量2.125g的KHP。将KHP放入1L容量瓶中，用零水（即去离子水）溶解。零水可以确保溶液中不含杂质，添加零水至1L刻度处，并混合均匀，得到标准储备溶液。建立标准曲线（如图1所示）取对照组和实验组第5天的藻液样品，于离心机中以3000r/min离心10分钟后，得到上清液样品。测定样品DOC（可溶性有机碳），表示藻液所含可溶性有机碳的量。图1标准曲线Figure1Standardcurve2.5重金属浓度测定2.5.1标准使用液配置分别配置每mL含镉0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0μg2%盐酸溶液，每mL含铜0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg2%硝酸溶液，每mL含锌0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μg2%盐酸溶液。2.5.2测定从各组小球藻中分别取出50mL藻液。将取出的藻液放入离心机内，以3000rpm的速度离心10分钟，得到上清液。离心后，小心地将上清液转移出来，作为后续分析的样品。这个步骤需要小心操作，以避免将藻细胞混入上清液中。所有样品利用原子吸收分光光度计在特定波长下进行重金属含量测定。原子吸收分光光度计是一种能够测量样品中特定元素含量的仪器。通过选择特定的波长，可以测量出样品中某种重金属的含量。每组进行3次重复实验，增加实验的可靠性和准确性。2.6环境因子对小球藻的影响2.6.1盐度测定海水盐度采用盐度计测定。用一次性的3mL胶头滴管吸取1mL藻液，滴在盐度计上，盖上盖子待读数稳定不变后，记下盐度读数。用去离子水洗涤后，用滤纸吸干水分，继续测定下一个样品。2.6.2pH测定采用电位法测定pH。取藻液置于50mL三角瓶中，将pH计的电极插入待测液中，静置1min后，读数，记下pH。取出电极，用超纯水洗涤后，立刻用干净滤纸吸干水分，再继续测定下一个样品。每测定5-6个样品后用标准缓冲液检查。2.7数据分析使用OfficeExcel2019进行数据统计，结果以平均值±标准差（mean±SD）表示，使用SPSS24.0对数据进行差异性分析，采用单因素ANOVA检验，LSD法进行多重比较;使用Origin2022对数据分析结果作图。2.8技术路线3结果与讨论3.1防晒剂与重金属对小球藻的抑制效应3.1.1藻细胞密度图2不同防晒剂处理第一天及第五天藻密度Figure2Algaedensityonday1andday5treatedwithdifferentsunscreens在含有重金属的海水中以防晒剂对小球藻进行5天的胁迫处理后，相较对照组而言，所有处理组的小球藻藻密度均呈现显著下降的趋势。对照组在第五天的藻密度为2.087×10⁷cells/mL，而处理组的藻密度则主要集中在9×10⁶cells/mL左右。值得注意的是，尽管EHS处理组的藻密度相较于其他处理组较大，达到了1.373×10⁷cells/mL，但在实验开始前，EHS处理组的藻密度就已经高于其他处理组，其初始藻密度为7.13×10⁶cells/mL，相较其他处理组的4.33×10⁶cells/mL、5.13×10⁶cells/mL和5.4×10⁶cells/mL更高。我们可以认为，尽管处理组之间藻密度存在差异，但各组的藻密度长势相差并不大。忽略初始藻密度等因素的影响，在生物量所受影响方面，几种防晒剂综合重金属的呈现的抑制作用是相似的，未表现出明显差异。3.1.2细胞密度抑制率图3不同防晒剂细胞密度抑制率Figure3Celldensityinhibitionrateofdifferentsunscreens经过计算分析，我们得到了如图4所示的抑制率数据。在四种选取的防晒剂中，EHS的抑制率显著低于其他防晒剂，仅为34.21%。相比之下，其他三种防晒剂的抑制率均大于50%，显示出较强的抑制作用。虽然这三种防晒剂的抑制率相差不大，但BP-3的抑制率仍为最高，达到了56.25%。值得注意的是，OMC和4-MBC的抑制率相同，均为55.29%，表明它们在抑制效果上较为接近。3.1.3小球藻细胞形态图4-1对照组图4-2EHS图4-3BP-3图4-44-MBC图4-5OMC以上小球藻观察均在光学显微镜100×10倍下进行小球藻呈典型的圆球形，胞体直径介于5至10微米之间。在含有重金属的海水中以防晒剂对小球藻进行5天的胁迫处理后，观察到对照组与处理组在细胞形态上并未展现出显著差异，与过往研究中防晒剂对微藻形态的毒性效应不符合。为了更全面地了解小球藻受到的影响，我们还需要进一步分析其他生理生化指标的变化，更深入地探讨防晒剂和重金属对小球藻生长和代谢的复合毒性机制。3.2防晒剂与重金属对小球藻胞外产物的影响图5不同防晒剂处理后DOC值Figure5DissolvedOrganicCarbonaftertreatmentwithdifferentsunscreens在含有重金属的海水中以防晒剂对小球藻进行5天的胁迫处理后，各组可溶性有机碳（DOC）含量均呈现减少趋势。具体而言，对照组的DOC含量为125.5mg/L，而OMC、4-MBC和EHS处理组的DOC含量降低的幅度相对较小，分别为120.23mg/L、116.31mg/L和119.17mg/L。然而，值得注意的是，BP-3处理组的DOC含量下降幅度较显著，降低至100.39mg/L。各组胞外产物分泌都受到抑制，尤其BP-3处理组，抑制作用极为显著。即重金属存在的情况下，海水小球藻胞外产物的含量降低。3.3重金属浓度图6-1不同防晒剂处理后藻液Cd浓度Figure6-1cadmiumconcentrationinalgalsapaftertreatmentwithdifferentsunscreens图6-2不同防晒剂处理后藻液Cu浓度Figure6-2AlgaeCopperconcentrationaftertreatmentwithdifferentsunscreens图6-3不同防晒剂处理后藻液Zn浓度Figure6-3zincconcentrationinalgalsapaftertreatmentwithdifferentsunscreens据图6-1可知，与对照组0.0039mg/L的Cd相比，OMC、4-MBC、EHS的Cd浓度较高，达到了0.0050mg/L以上，而BP-3的Cd浓度较小，为0.0036mg/L。而由图6-2知，与对照组0.0079mg/L的Cu相比，所有处理组（包括OMC、4-MBC、EHS和BP-3）的Cu浓度都更大。OMC、BP-3分别为0.0169和0.0178mg/L。4-MBC处理组Cu浓度最大，达到了0.0367mg/L，EHS次之，为0.0278mg/L。Zn浓度与Cu浓度分布相同。所有处理组的Zn浓度都有所增加，与对照组0.0028mg/L的Zn相比，OMC、4-MBC、EHS、BP-3的Zn浓度均较大，但有所差异，其中OMC、BP-3的较小，分别为0.0243和0.0145mg/L。4-MBC最大，达到了0.0412mg/L。EHS次之，为0.0314mg/L。三种重金属的浓度数据，正好与胞外产物的DOC含量相契合，肯定了重金属存在的情况下，海水小球藻胞外产物的含量会降低的结论。并且重金属含量越低，DOC越低，说明胞外产物分泌越少。3.4环境因子对小球藻的影响3.4.1盐度图7不同防晒剂处理后藻液盐度Figure7Algaesalinityaftertreatmentwithdifferentsunscreens各组盐度均保持在相同的水平，即35‰，因此我们可以排除盐度对实验结果造成的干扰。3.4.2pH图8不同防晒剂处理后藻液pHFigure8AlgaepHaftertreatmentwithdifferentsunscreens经过测定，发现各处理组之间的pH值存在差异。尽管这些差异可能潜在地影响各参数的测定，尤其是对重金属吸附过程的影响，但由于实际数值的差距相对较小，这种影响可能并不显著。以图8为例，对照组的pH值为8.47。在OMC、4-MBC、EHS、BP-3等不同处理条件下，藻液的pH值均有所上升。具体来说，EHS处理组的pH值最高，为9.38；其次是4-MBC处理组，pH值为9.29；OMC处理组的pH值为9.05；而BP-3处理组的pH值相对较低，为8.97。这些细微的pH值变化可能在一定程度上反映了不同处理条件对藻液环境的影响，但具体影响程度可能需要另外进行研究和分析。4结论与展望4.1结论1.在含有重金属的海水中对小球藻进行5天的胁迫处理后，我们发现防晒剂会显著抑制海水小球藻的生长，使其生物量低于正常生长的情况。不同防晒剂表现出了不同的抑制率：EHS的抑制率较低，而OMC、4-MBC、BP-3显示出较强的抑制作用，其中BP-3的抑制率最高，OMC和4-MBC的抑制率次之，且抑制效果较为接近。此外，对照组与处理组在细胞形态上并未展现出差异。2.在含有重金属的海水中对小球藻进行5天的胁迫处理后，各组溶液盐度均保持在相同的水平，可以排除盐度对实验结果造成的干扰。而各防晒剂处理组之间的pH值存在差异。不同处理条件下，藻液的pH值均有所上升。EHS处理组的pH值最高，其次是4-MBC处理组、OMC处理组，而BP-3处理组的pH值最低。但由于实际数值的差距较小，不会造成显著影响。3.经过防晒剂处理后，各组藻液中胞外产物测得的DOC含量均呈现减少趋势。尤其是BP-3处理组，DOC含量下降幅度较显著。这表明，BP-3处理组的胞外产物分泌受到显著的抑制。结合三种重金属浓度分析后，我们发现：BP-3处理组的Cd、Cu、Zn浓度基本都低于其他防晒剂处理组，与DOC浓度的变化趋势吻合，OMC和EHS处理组也展现出了类似的趋势。但4-MBC组的数据并不符合这一规律，说明它的毒性机制有所不同。综合以上，我们得出结论：重金属的存在，有助于降低有机防晒剂的毒性作用，减弱海洋微藻的应激反应。因此作为应激反应的重要组成部分，胞外产物的含量相应降低。4.2展望本研究有助于科学评估防晒剂与重金属两种污染物对海洋生态系统的影响，能够为修复海洋生态环境提供重要的基础数据。然而，许多数据的影响机制尚未深入了解，应后续补充实验进行探究；以及应使用更多种类的海洋微藻及防晒剂，结合重金属进行研究，深入探讨，并从中揭示防晒剂和重金属对微藻的联合毒性抑制作用，为客观评价这两种污染物的海洋生态影响提供依据[18]。参考文献：贾顺义.不同盐度及氮磷浓度对紫球藻生长代谢的影响[D].大连理工大学,2006.李国强.植物激素诱导微藻生产生物柴油和高附加值次生代谢物的研究[D].山东理工大学,2016.刘思彤.微塑料在水体中对重金属的吸附及对小球藻联合毒性研究[D].天津大学,2021.李瑶.普生小球藻培养条件及脂肪酸提取工艺优化[D].东北林业大学,2013.荆红梅.海洋微藻胞外产物的实验研究[D].厦门大学,2002.刘铮铮.典型微塑料与微藻的交互作用机制与机理研究[D].天津大学,2020.苏芳,苏明德.PAN微塑料胁迫下胞外聚合物对小球藻生长及光合特性的影响[J].生物化工,2023,9(04):35-38.辛月星.不同Na~+离子强度下菌藻团聚过程表征及机制研究[D].华中农业大学,2020.董为.典型二苯甲酮类紫外防晒剂在氯化、氯胺化、UV/氯