高效液相色谱知识收藏

高效液相色谱知识收藏

Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤AgilentllOO液相基本操作步骤

AgilentllOO高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法

液相色谱柱使用及保养

高压液相色谱HPLC培训教程（一）

高压液相色谱HPLC培训教程（七）

高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生

HPLC对流动相的基本要求

高效液相色谱

Waters600E-2487HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程

高效液相色谱仪（Agilent1100）操作注意事项

色谱扫盲班

AgilentllOO高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤

（一）、开机：

1、打开计算机,进入WindowsNT（或Windows2000）画面，并运行Bootp

Server程序。

2、打开1100LC各模块电源。

3、待各模块自检完成后，双击Instrument1Online图标，化学工

作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。

4、从“View”菜单中选择uMethodandRuncontrolw画面，单击”

View”菜单中的“ShowTopToolbarn,aShowstatustoolbarwuSystem

diagram"，"Samplingdiagram”，使其命令前有"J”标志，来调用所需的

界面。

5、把流动相放入溶剂瓶中。

6、打开Purge阀。

7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入泵

编辑画面。

8、设Flow：5ml/min,单击OK。

9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pumpcontrol选项，选中

On,单击0K,则系统开始Purge,直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为

止,切换通道继续Purge,直到所有要用通道无气泡为止。

10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中

Off,单击0k关泵，关闭Purgevalve。

11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入Pump

编辑画面，设Flow：1.0ml/mino

12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵

的体积。单击Ok。

（二）数据采集方法编辑：

1、开始编辑完整方法：

・从“Method”菜单中选择"Editentiremethod,,项，如上图所

示选中除“Dataanalysis”外的三项，单击0k,进入下一画面。

2、方法信息：

•在“MethodComments,,中加入方法的信息（如：方法的用途等）。

・单击0k进入下一画面。

3、泵参数设定：（以二元泵为例）

•在“Flow”处输入流量，如Iml/min,在“SolventB”处输入

70.0,（A=100-B），也可Insert一行"Timetable”，编辑梯度。在Pressure

LimitsMax”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

•单击0k进入下一画面。

4、自动进样器参数设定：

・选择合适的进样方式，进样体积l.Oul,洗瓶位置为6号。

uStandardInjection只能输入进样体积，此方式无洗针功能。"Injection

withNeedleWash”一一可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽

完样品后，会在洗瓶中洗针。"Useinjectorprogram--可以点击Edit键

进行进样程序编辑。

・点击0k进入下一画面。

5、柱温箱参数设定:

•在"Temperature”下面的方框内输入所需温度，并选中它，点击”

more〉”键，如图所示，选中"Sameasleft"—-使柱温箱的温度左右一致。

•点击ok进入下一画面。

6、VWD检测器参数设定：

•在"Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长，如

254nm,在“Peakwidth(Responsetime)”下方点击下拉式三角框，选择合

适的响应时间，如＞0.lmin(2s)。

•在Timetable中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波

长，如Imin,波长二300nm。点击ok进入下一画面。

7、DAD检测器参数设定：

・检测波长：254nm,BW=30nm,参比波长

=350nm,BW=100nm;

・检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW：一般

选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无

吸收或低吸收区域。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下

用100nm作为缺省值。Peakwidth(Responsetime)：其值尽可能接近要测的

窄峰峰宽。Slit一狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集

光谱方式，步长，范围，阈值c选中所用的灯。

・点击0k进入下一画面。

8、RID检测器参数设定：

・色谱条件：

进样体积：20ulo光学单元温度：Offo

极性：正c峰宽（响应时

间）：4s

・aOpticalUnitTemperaturev--若环境温度控制在±2℃,

设定为Off,若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度，

以防样品在池中沉淀。"Peakwidth”--大多数分析设为4S,只有在高速分析

下设为更短。"Automaticrecyclingafteranalysis”在不进行分析时可

以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。

・点击RID图标，选择RIDControl：Heater设为On,若要

循环流动相,必须将"RecyclingValve"设为ON。手动purge参比池,将其

设为On,并输入Purge时间。

9、FLD检测器参数设定：

色谱条件:

样品：P/N01018-68704用甲醇稀释为1:10。

进样体积：5ulo

柱温箱：30℃oEX=246nm,

EM=317nm,PMT=10o

响应时间=4s.停止时间：出峰完毕。

ExcitationA:激发波长：200-700nm,步长为Inm,

或ZeroOrdero

Emission:发射波长：280-900nm,步长为Inm,

或ZeroOrdero

PMT:大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样

品峰被切平头，则减少PMT值,

“Peakwidth”：大多数应用设为4s,只有快速分析采

用小的设定值。

•MultiEx：多波长及光谱（激发）。

•MultiEm：多波长及光谱（发射）。

•同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。

10^在“Runtimechecklist"中选中"Dataacquisition^,

单击Oko

11、单击“Method”菜单，选中“Savemethodas"，输入一方法

名，如“test”，单击Oko

12^从菜单“View"中选中"Onlinesignalw，选中Windows1,

然后单击Change钮,将所要绘图的信号移到右边的框中，点击Ok.（如同时检测

二个信号，则重复12,选中Windows2）o

13>从"Runcontrol”菜单中选择"Sampleinfo”选项，如

上图所示,输入操作者名称,在"Datafile"中选择"Manual"或"Prefix”。

区别：Manual—每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上

次的数据覆盖。Prefix一在Prefix框中输入前缀，在Counter框中输入计数

器的起始位，仪器会自动命名，如vwdOOOl,vwd0002……。

14、从Instrument菜单选择Systemon。

15>等仪器Ready,基线平稳,从Method菜单中选择"Runmethod”，

进样。

（三）、数据分析方法编辑:

1、从"View”菜单中，单击“Dataanalysis,,进入数据分析画面。

2、从“File”菜单选择“Loadsignal”，选中您的数据文件名，如下

图所示。单击0k。

3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signaloptions”选项，。

从Ranges中选择Autoscale及合适的显示时间，单击ok,或选择”UseRanges”

调整。反复进行，直到图的比例合适为止。

4、积分：

(1)、从"Integration"中选择"Autointegrate”,如积分结果

不理想，再从菜单中选择“IntegrationEvents”选项，选择合适的Slope

sensitivity,Peakwidth,Areareject,Heightrejecto

(2)、从"Integration”菜单中选择"Integrate”选项，则数

据被积分。

(3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

(4)、单击左边“J”图标，将积分参数存入方法。

5、打印报告：

(1)、从"Report”菜单中选择"Specifyreportw选项，进入如

上画面。

(2)、单击uQuantitativeResults”框中Calculate右侧的黑

三角，选中Percent(面积百分比)，其它选项不变。

(3)、单击0k.

⑷、从"Report"菜单中选择"Printreport"，则报告结果将

打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report底部的“Print”钮。

（四）、关机:

•关机前，用100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲

洗系统10分钟（如ACN）,然后关泵，（适于反相色谱柱）。［正相色谱柱用适

当的溶剂冲洗］

•退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shutdown

关）。

关掉Agilent1100电源开关。

AgilentllOO高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：

1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相

色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）

2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀

数次，每次数毫升。

3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸储水（易长菌）。

4、带seal-wash的1100,要配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度虹

吸排出，溶剂不能干涸。

5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。

维护知识问答

1、为什么溶剂和样品要过滤？

溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由

于污染对分析结果的影响。

色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使

色谱柱和毛细管容易堵塞。

仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵

头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

样品过滤头的类型：

30mn内径：适用于大进样量的过滤，由0.2Rm和0.4511m两种规格，材料有纤

维素，醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50口1。

13mn内径：适用于范围广的过滤，由0.2um和0.45nm两种规格，材料为纤维

素。

3nlm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2um和0.45Um两种规格。处理样品

体积为7

滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。

醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和

其相关样品。

尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二

氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。

2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？

HPLC用缓冲盐时，由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的

细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动，

容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有

效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.Imol或大于0.Imol时,必

须使用该在线冲洗选项.

清洗液配制：90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水

的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。

3、为什么AgilentU00LC的流动相管路非常细？

在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品

分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流

速也比气相慢「2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死

体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会

引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析

结果，Agilent1100LC使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。

毛细管线分类：0.17mm内径------绿色；0.12mm内径-------红

色。

PEEK管线：内径-----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mmo

毛细管线优点：柔韧性好.

^Agilent公司同时备有l/16in的粗外径毛细管线，适用于不同习惯的用户，

优点是刚性好，但柔韧性差一些。

4、流动相使用前为什么要脱气？

流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如02）,

以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。

气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导

致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD,

可能会造成荧光猝灭。

常用的脱气方法比较：

氯气脱气法：利用液体中氯气的溶解度比空气低，连续吹氮脱气，效果较好，

但成本高。

加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。

抽真空脱气法：易抽走有机相C

超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min,此法效果最

差。

在线真空脱气法：AgilentllOOLC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能

控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多

元溶剂体系。

5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？

溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运

行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4一7）。以下几种方法可以有效防止溶剂

瓶内溶剂过滤器的堵塞。

A：请严格执行溶剂过滤。

B：请勿使用多日存放的蒸储水及磷酸盐缓冲液

C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001--0.001M的叠氮化钠.

D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹鼠气，以隔绝空气。

E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷

酸盐缓冲液。

堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸

泡lh,然后用二次蒸储水冲洗干净并超声处理。

6^Agilent1100LC泵如何维护?

Agilent1100LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及

时合理的维护非常重要。

A：流动相使用前请必须脱气、过滤。

B：使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。

C：关机前，用100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟

（如甲醇），然后关泵，（适于反相色谱柱）。［正相色谱柱用适当的溶剂冲洗］

D：及时更换PurgeValve内的过滤芯。（当打开PurgeValve时,压力高于lObar,

表明过滤芯已堵•）。E：使用合适的密封圈。

7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？

泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己

烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同

的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905T4202/pk）

***注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0—200bar；建议在泵的压力限制

中，将最大压力设为200bar。

8、使用梯度比例发时要注意那些事项？

当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，

而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常,

阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并

被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。

强烈建议：当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A

通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上：定期用水冲洗所有的

通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。

9、在线真空脱气机使用要注意那些事项？

一般来说，Agilent1100LC的真空脱气机无需过多维护，只需注意几

个注意事项就可以了。

A：第一次使用，要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体；更换不同类型的溶

剂时，要先抽空，再抽满。

B：不用的通道要充满溶剂或密闭起来。

10、更换色谱柱时要注意什么事项？

在使用HPLC时,应特别注意“柱外效应”对分析结果的影响，由于样品

分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流

速也比气相慢—2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死

体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会

引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析

结果，仪器的流动相管路连接非常重要，一般AgilentU00LC在第一次安装时,

均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只

需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接

头，柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头，当完成第一次安张后，

不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，

否则会产生一个非常大的死体积。

11、手动进样阀需做那些维护，使用时要注意什么？

对于手动进样器，当使用缓冲溶液后，或者进浓度差异比较大的样品时

要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每

次数毫升。

注意事项：

•安装时六通阀的5,6出口要与注射器在同一水平线上，以防止虹吸

现象的发生，导致进样量的重复性变异。

・进样量的多少要根据定量管的LOOP体积决定。

当样品量少时：进样体积由注射器的进样体积决定，但最大进样体积要

小于l/21oop体积。

当样品量较多时：进样体积由定量管的体积决定，为保证样品完全把定

量管的流动相置换干净，需注射5—6倍的LOOP体积。

・要使用专用的液相注射器进样，绝对不可以用气相的注射器。

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法诊状

（一）保留时间变化

可能的原因：解决方法

1.柱温变化：柱恒温

2.等度与梯度间未能充分平衡：至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

3.缓冲液容量不够：用＞25mmol/L的缓冲液

4.柱污染：每天冲洗柱

5.柱内条件变化：稳定进样条件，调节流动相

6.柱快达到寿命：采用保护柱

（二）保留时间缩短

可能的原因：解决方法

1.流速增加：检查泵，重新设定流速

2.样品超载：降低样品量

3.键合相流失：流动相PH值保持在3、7.5检查柱的方向

4.流动相组成变化：防止流动相蒸发或沉淀

5.温度增加：柱恒温

（三）保留时间延长

可能的原因：解决方法

L流速下降：管路泄漏，更换泵密封圈,排除泵内气泡

2.硅胶柱上活性点变化：用流动相改性剂，如加三乙胺，或采用碱至钝化柱

3.键合相流失：同前（二）3

4.流动相组成变化：同前（二）4

5.温度降低：同前（二）5

（四）出现肩峰或分叉

可能的原因：解决方法

1.样品体积过大：用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15%

2.样品溶剂过强：采用较弱的样品溶剂

3.柱塌陷或形成短路通道：更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件

4.柱内烧结不锈钢失效：更换烧结不锈钢,加在线过滤器，过滤样品

5.进样器损坏：更换进样器转子

（五）鬼峰

可能的原因：解决方法

L进样阀残余峰：每次用后用强溶剂清洗阀，改进阀和样品的清洗

2.样品中未知物：处理样品

3.柱未平衡：重新平衡柱,用流动相作样品溶剂（尤其是离子对色谱）

4.三氟乙酸（TFA）氧化（肽谱）：每天新配，用抗氧化剂

5.水污染（反相）：通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水

（六）基线噪声

可能的原因：解决方法

L气泡（尖锐峰）：流动相脱气，加柱后背压

2.污染（随机噪声）：清洗柱，净化样品，用HPLC级试剂

3.检测器灯连续噪声：更换笊灯

4.电干扰（偶然噪声）：采用稳压电源，检查干扰的来源（如水浴等）

5.检测器中有气泡：流动相脱气，加柱后背压

（七）峰拖尾

可能的原因：解决方法

L柱超载：降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相

2.峰干扰：清洁样品，调整流动相

3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,

钝化样品

4.同前（四）4:同前（四）4

5.同前（四）35.:同前（四）3

6.死体积或柱外体积过大：连接点降至最低，对所有连接点作合适调整，尽可

能采用细内径的连接管

7.柱效下降：用较低腐蚀条件,更换柱，采用保护柱

（八）峰展宽

可能的原因：解决方法

L进样体积过大：同（四）1

2.在进样阀中造成峰扩展：进样前后排出气泡以降低扩散

3.数据系统采样速率太慢：设定速率应是每峰大于10点

4.检测器时间常数过大：设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%

5.流动相粘度过高：增加柱温，采用低粘度流动相

6.检测池体积过大：用小体积池,卸下热交换器

7.保留时间过长：等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱

8.柱外体积过大：将连接管径和连接管长度降至最小

9.样品过载：进小浓度小体积样品

液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部

分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液

相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

一、液相色谱柱的安装：

1、液相色谱柱的结构：

a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸

外螺纹，另一端是3/16英寸的内螺纹（国内外已规范化）。7/16英寸外螺纹与

1/4英寸柱管（①6.35mm）连接，中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹

与1/16英寸（①1.57mm）的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。

为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用①1.57m皿连接管通过空心螺钉

压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍

在连接管上（连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固

定尺寸）。

在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片（或滤网），用于封堵柱

填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一

般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意,

柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

b、柱填料:

液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据

填料类型而定。

正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒

直径在3—10um的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合一CN,-NH2等官

能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非

极性填料。也有无定型和球型之分。

常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—

10Um之间。

2,色谱柱的安装：

a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的

溶剂。

b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。

c、按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀

出口相连接（如条件允许，建议在柱前使用保护柱）；柱的出口与检测器连接。

连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空

心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心

螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，

再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动

相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1/4圈，直至不漏液为止。

二、液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结昊保存起来，作为今后

评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、

柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报

告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件），只有这样，测得的结果

才有可比性。

1、样品的前处理：

a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45um的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制：

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目

的，因此要求流动相具备以下的特点：

a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或

长时间保留在柱中）。

b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应（特殊情况除外）。

c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离

效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流

动相的黏度）。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好

使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气

体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择：

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱

效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为

4.6nm的色谱柱，流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml

/min为佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的

方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙睛的含量）。

注意：

a.由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系（必须使用乙月青的场合除

外）。

b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油酸或提纯后的己烷作流动

相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水（电阻率大于18兆欧），去

离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

c.含水流动相最奸在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相

不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

d.流动相要求使用0.45um滤膜过滤，除去微粒杂质。

e.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用

寿命，提高柱性能。

4、柱性能测试：

启动液相色谱仪：a、流动相流速设定为1ml/min。

b、UV检测器波长设定为254nm。

使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。

记录并计算测试结果。

*参考(标准JB5226-91)液相色谱仪测试用标准色谱柱。

高压液相色谱HPLC培训教程(一)I.概论

一、液相色谱理论发展简况

色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定

相时,由于与固定相(stationaryphase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、

排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定

相中流出。又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸

钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础

上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差

输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。

高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)是在经典

液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引

起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquid

Chromatography,IIPLC)o又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeed

LiquidChromatography,HSLP)。也称现代液相色谱。

二、HPLC的特点和优点

HPLC有以下特点：

高压-压力可达15(f300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。

高速-流速为0.P10.0ml/mino

高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.Olngo同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快-通常分析一个样品在15~30min,有些样品甚至在5min内即可完成。

分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高-紫外检测器可达0.Olng,荧光和电化学检测器可达0.Ipgo

柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

三、色谱法分类

按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色

谱法适用于分离挥发性化合物cGC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)

和气液色谱法(GLC),其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或

非挥发性、热稳定性差的物质cLC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法

(LLC)o此外还有超临界流体色谱法(SFC),它以超临界流体(界于气体和液体

之间的一种物相)为流动相(常用C02),因其扩散系数大，能很快达到平衡，

故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。

按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、

排阻色谱法(EC,又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC)和亲和

色谱法，此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、

柱色谱法。

四、色谱分离原理

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱

法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1.液固色谱法

使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分

吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附一解吸附的平衡过程。常用的吸

附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10um。适用于分离分子量2001000的组分，大

多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2.液液色谱法

使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的

固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。

分离过程是一个分配平衡过程c

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减

少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的

变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布

式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固

定相，如C18、C8、氨基柱、氟基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反

相色谱法（RPC）。

正相色谱法

采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与月青基键合相）；流动相为相对非极

性的疏水性溶剂（烷烧类如正己烷、环己烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢吠喃、

三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物

（如酚类、胺类、粉基类及氨基酸类等）。

反相色谱法

一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲

醇、乙庸、异丙醇、丙酮、四氢吠喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。

适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，

据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于

某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲

液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5V.5

（2'8）,太高的pH值会使硅胶溶解,太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报

告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱

法反相色谱法

固定相极性高〜

中中〜低

流动相极性低〜

中中〜高

组分洗脱次序极性小先洗

出极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如

氨基键合固定相）。

3.离子交换色谱法

固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，

在表面未端芳环上接上竣基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子

交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中

具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换

基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保

留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相

的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相

的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较

快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4.离子对色谱法

又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离

子束试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从

而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺

酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季钱盐，如四丁基溟化钺、四丁基镂磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18）,流动相为甲醇-水或乙月青-水，水

中加入310mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分

保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

5.排阻色谱法

固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小

分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长：大分子量的化合物不能进入孔中，

直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异

而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸

等。

高压液相色谱HPLC培训教程(二)II.基本概念和理论

一、基本概念和术语

1.色谱图和峰参数

色谱图(chromatogram)一样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，

又称色谱流出曲线(elutionprofile)o

基线(baseline)一经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时

间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

噪音(noise)一基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳

定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

漂移(drift)一基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动

相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂

移。

色谱峰(peak)一组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的

突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对

称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)<>前者少见。

拖尾因子(tailingfactor,T),用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子

(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)o《中国药典》规定T应

为0.95~1.05。TV0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。

峰底-基线上峰的起点至终点的距离。

峰高(peakheight,h)一峰的最高点至峰底的距离。

峰宽(peakwidth,W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。

W=4o

半峰宽(peakwidthathalf-height,Wh/2)一峰高一半处的峰宽。Wh/2=2.355

o

标准偏差(standarddeviation,。)-正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽

之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色

谱柱过程中的分散程度。。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；

反之，。大，峰形胖、柱效低c

峰面积(peakarea,A)-峰与峰底所包围的面积。

2.定性参数(保留值)

死时间(deadtime,tO)一不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色谱

柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

死体积(deadvolume,V0)—由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据

的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被

流动相占据、Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色

谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽

量减小。V0=FXt0(F为流速)

保留时间(retentiontime,tR)一从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大

值的时间。

保留体积(retentionvolume,VR)一从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大

值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=FXtR

调整保留时间(adjustedretentiontime,t'R)--扣除死时间后的保留时间。

也称折合保留时间(reducedretentiontime)o在实验条件(温度、固定相等)

一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R(或tR)可用于定性。t，R=tR

-to

调整保留体积(adjustedretentionvolume,V'R)一扣除死体积后的保留体积。

3.柱效参数

理论塔板数(theoreticalplatenumber,N)--用于定量表示色谱柱的分离效率

(简称柱效)。

N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相

的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组

分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测

定，尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，

则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

若用调整保留时间(fR)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或

Neff)o

理论塔板高度(theoreticalplateheight,H)—每单位柱长的方差。实际应用

时往往用柱长L和理论塔板数计算。

4.相平衡参数

分配系数(distributioncoefficient,K)一在一定温度下，化合物在两相间达

到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力

有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离

子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。但一般

情况可用分配系数来表示。

在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、

Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱

条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增

大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时

色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒

定时，才能获得正常峰。

在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流

出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配

系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离

的前提。

在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠

调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时

间，达到分离的目的。

容量因子（capacityfactor,k）一化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相

与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。

容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是

不保留组分保留时间（tO）的几倍。k=0时，化合物全部存在于流动相中，在

固定相中不保留，t'R=0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，

保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性

质及温度，而与体积Vs、Vm无关：k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有

关。由于t'R、tO较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。

选择性因子(selectivityfactor,a)一相邻两组分的分配系数或容量因子之

比。a又称为相对保留时间(《美国药典》)。

要使两组分得到分离，必须使aWl。a与化合物在固定相和流动相中

的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，a

的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用

力的差异。

5.分离参数

分离度(resolution,R)一相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分

辨率，表示相邻两峰的分离程度。R=o当W1=W2时，R=o当R=1时，称为4

。分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4临内侧峰基重叠约2%。R=L5时,

称为6。分离，裸露峰面积为99.7%。R21.5称为完全分离。

中国药典规定R应大于1.5o

提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样

会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加

选择性。当a=1时，，R=0,无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采

取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改

变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调

节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2

不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏

度。一般k2在广10范围内，最好为2~5,窄径柱可更小些。

高压液相色谱HPLC培训教程（三）二、塔板理论

1.塔板理论的基本假设

塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色

谱柱看作分储塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分储塔中的分储过程，

即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：

1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配

定律，并很快达到分配平衡。

2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。

3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。

4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。

虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难

达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出

了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能

够评价色谱柱柱效。

2.色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）

由色谱流出曲线方程可知：当1=11?时，浓度C有极大值。Cmax就是色

谱峰的峰高。因此：①当实验条件一定时（即。一定），峰高h与组分的量CO

（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时，

。越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。

由流出曲线方程对V（0、8）求积分，即得出色谱峰面积A。可见A相当

于组分进样量CO,因此是常用的定量参数。把^^=11和阳1/2=2.355。代入

上式，即得A=1.064XWh/2Xh,此为正常峰的峰面积计算公式。

三、速率理论（又称随机模型理论）

1.液相色谱速率方程

1956年荷兰学者VanDeemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔

板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论一速率理论。它

把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展览（即

柱效）的影响。

后来Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（后称气相色谱速率

方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即

Giddings方程）.

2.影响柱效的因素

1）涡流扩散（eddydiffusion）o由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子

在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2Xdp,dp为填料直径,

人为填充不规则因子，填充越不均匀入越大。HPLC常用填料粒度一般为：CIOu

m,最好3~5um,粒度分布RSDW5%。但粒度太小难于填充均匀（入大），且会

使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，入越小。

总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，A=

Oo

2）分子扩散（moleculardiffusion）o又称纵向扩散。由于进样后溶质分子

在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u=2丫

Dm/uou为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。

在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液

相的Dm很小，通常仅为气相的10-4~10-5,因此在HPLC中，只要流速不太低的

话，这一项可以忽略不计。Y是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向

扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。Y一般在0.6〜0.7左右，毛细管

柱的Y=1。

3）传质阻抗（masstransferresistance）。由于溶质分子在流动相、静态流

动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的

扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一

时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱

的传质阻抗项Cu又分为三项。

①流动相传质阻抗Hm=Cmd2pu/Dm,Cm为常数。这是由于在一个流路中

流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较

快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而

产生峰展宽。

②静态流动相传质阻抗Hsm=Csmd2pu/Dm,Csm为常数。这是由于溶质

分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm

对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔

径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流

动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。

Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2P成正比，与扩散系数Dm成反比。

因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm,但用有机溶剂

作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。

③固定相传质阻抗Hs=Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为

固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df

的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层

固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采

用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。

从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措

施：①进样时间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力

可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以