细胞培养的知识

细胞培养的知识细胞培养的知识细胞培养的知识xxx公司细胞培养的知识文件编号：文件日期：修订次数：第1.0次更改批准审核制定方案设计，管理制度细胞培养的无菌环境、常用培养器皿及清洗消毒(2008-08-2311:00:58)标签：细胞培养

无菌环境

常用

培养器皿

清洗

消毒

杂谈

细胞培养的无菌环境

一、无菌室

无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。

无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2h），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2h）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。

此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。

二、超净工作台

工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。

超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射10－30min，然后让超净台预工作10－15min，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。

常用培养器皿及清洗消毒

细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。

一、清洗

离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗4个步骤。

1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

2.刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。

3.浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于6h，一般过夜或更长。放取器皿要小心。

4.冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。

（二）橡胶制品清洗

新的橡胶制品洗涤方法：LNaOH煮沸15min，流水冲洗，LHCl煮沸15min，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20min，50℃烤干备用。

（三）塑料制品的清洗

塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗3次，双蒸水泡24h，晾干备用。

（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

二、消毒和灭菌微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因

（一）物理消毒法

1.紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。

紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2m的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3h，期间可间隔30min。灯管离地面2米以外要延长照射时间，照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过，照射时间30min为宜。

紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。

2.高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。

不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。

3.高温干热消毒:干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。

干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。

烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。

4.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。

（二）化学消毒：新洁而灭，其％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。

（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。

可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。

细胞培养时的无菌操作及工作常规

一、无菌操作

1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30～60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。

2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。

实验人员用%过氧乙酸水泡手，擦干。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3、点燃酒精灯，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。水平式风机的超净台，容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，应尽量避免瓶口敞开直立。使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。

同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。

4、工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣、手套和帽子后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。

5、定期检测下列项目：①CO2钢瓶之CO2压力；②CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；③无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。

6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。

二、实验用品

1、种类：①细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。②TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates，dishes，rollerbottle等，依实验需要使用。③plasticsterilepipet:1ml，2ml，5ml，10ml，25ml。④塑料离心管:15ml，50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。⑤glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。⑥玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml，250ml，500ml，1000ml。

三、清洗

1、玻璃器皿的清洗

一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。

（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。新购玻璃瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液（～HCl）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿，用后要立即完全浸入水中，不能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗后的玻璃器皿要用鼓风干燥箱干燥。

（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）（A）强清洁液63∶1000∶200000（B）次强清洗液120∶200∶1000（C）弱清洁液100∶100∶100。清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。

（4）冲洗：浸酸后必须用水充分冲洗。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净（流水过夜），然后用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用（用鼓风干燥箱干燥）。

2、胶塞的清洗

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH煮沸10～20分钟。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10～20分钟，晾干备用。

3、金属用品的清洗

先用自来水反复刷洗或冲洗，然后用蒸馏水浸泡。

四、灭菌

1、实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃，15lb，20分钟，置于oven中烘干。

2、实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170℃，4小时。

3、液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121℃，15lb，20分钟处理。体外细胞培养一般过程(2008-08-2309:24:57)标签：细胞培养

细胞分化

体内外细胞

差异

培养方法

杂谈

体外培养的概念

体外培养（invitroculture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。

●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。

●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。

●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。

体内、外细胞的差异和分化

1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

2.分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。

细胞培养的一般过程

一、准备工作

准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

二、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

三、培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。

四、冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

五、常用仪器设备

无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。细胞、组织培养大中一、组织培养的基本概念

Tissueculture:从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。

体外培养

细胞培养目的与用途

1、科学研究：药物研究开发与基础研究

(1)新药筛选：(2)疫苗研究与开发：(3)基因工程药物研究与开发：(4)细胞工程药物研究与开发：(5)单克隆抗体制备：药物作用机理基因功能(7)疾病发生机理

2、生物制药

(1)疫苗生产：(2)基因工程药物生产：(3)诊断用和药用单克隆抗体生产

(4)细胞工程药物生产：

对组织培养的评价

优点：1、直接观察活细胞的形态结构和生命活动。2、便于用各种不同技术方法研究细胞。3、培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，广泛用于分子生物学和基因工程研究。4、同时提供大量的生物学性状相似的实验对象。

不足：利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞一样。

组织培养的发展简史

1、早期组织培养:Roux（1885）用温NS培养鸡胚。Jolly(1903)用盖片悬滴法培养蝾螈白细胞。BeebeandEwing(1906)培养狗淋巴细胞。

2、现代组织培养：Harrison(1907)andCarrel(1912)开始，Harrison培养蛙胚神经组织。Carrel培养了鸡胚心肌组织。

3从50年代起，组织培养技术快速发展。试管培养

组织培养细胞生物学

一、体内外细胞的差异

“反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。

二、培养细胞的分化

1、不适应（deadaption)细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）

2、脱分化或去分化（Dedifferentiation):细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉储存肝糖原能力）

培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。

细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子。

培养细胞的形态分类

分为贴附型和悬浮型两大类

（一）贴附型

1、成纤维型细胞：心肌细胞、平滑肌、血管内皮细胞等

2、上皮型细胞

3、游走型细胞

4、多形型细胞

培养细胞的生长和增殖过程

（一）组织培养细胞生命期：原代培养期

传代期衰退期

原代培养（primaryCulture)从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。

传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。

细胞系（cellline)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。

无限细胞系：细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。

克隆形成率（CloningEfficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。

克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群.

（二）组织培养细胞一代生存期

1、潜伏期（Latentphase):细胞从悬浮状态贴附于底物表面上。原代培养细胞贴附慢（10-24h）。连续细胞系贴附快（10-30min)。

细胞贴附受多种因素影响

（1）支持物：底物表面要清洁，底物表面有阳性电荷有利于细胞贴壁。

（2）一些特殊物质的存在：血清

2指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。持续3-5天。

细胞分裂指数（MitoticIndex,MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.

3、停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖。

培养细胞生存环境、条件和代谢

一、无污染环境

二、温度：

三、气体环境和pH

四、培养细胞生存所需基本物质

1、糖2、氨基酸3、各种维生素

4、促生长因子*：血清*

5、其他物质

五、渗透压

培养基*

合成培养基（SyntheticMedium)

天然培养基（NaturalMedium)

血清，以牛血清和马血清为最常用。血清内含有多种促细胞生长因子，促贴壁因子及其它活性物质等。

一般需加10%-20%。

附着底物：

1、玻璃

2、一次性聚氯乙烯材料

3、饲细胞（Feedercell)

用成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢功能。将特殊难培养的细胞接种于其上。

体外培养细胞成功率分析

成功的关键:培养物必须贴附在底物上

细胞生长和增殖

一、组织和细胞的供体年龄

二、培养条件

三、贴附底物

四、培养方法：酶消化分离

组织培养设施和基本条件

实验室设计

细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌。操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

常用设施及设备

（1）超净工作台：。

（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作

台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及

消毒好的无菌物品等。

（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物

（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。

（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。

培养器皿

常用的器皿有下面几种。

（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml。

（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种

（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm

（4）培养板

培养用液

平衡盐溶液（BalancedSaltSolution,BSS)

天然培养基(NaturalMedium)

合成培养基(SyntheticMedium)

Hanks’平衡盐溶液（Hanks’BalancedSaltSolutions，HBSS）

成分含量（g/L）

CaCl2(无水氯化钙)

KCl

KH2PO4

MgCl2·6H2O

MgSO4·7H2O

NaCl

NaCO3

Na2HPO4

D-Glucose

PhenolRed

钙镁有促使细胞凝聚作用,配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时,宜采用D-Hanks

天然培养基

血清细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清

热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量

合成培养基

一、种类

RPMI1640：适用于很多细胞的生长，特别是血液细胞。

DMEM（Dulbecco’minimumessentialmedium)(高糖和低糖）低糖对肿瘤细胞有力。

HamF12和Mc-Coy5A多用于难培养的细胞。

合成培养基的成分：

1、氨基酸2、碳水化合物3、维生素

4、无机离子

5其它成分：在杂交瘤技术中，常在DMEM培养基中加入2-巯基乙醇（2-Me).2-Me对细胞的生长有非常重要的作用，能诱导细胞增殖。常配成储存液，用时每升培养液加.

培养液的配制

1、玻璃三蒸馏水

2、把干粉加入温（15-30度）水中，搅拌使其溶解；

3、加NaHCO3;

4、加水至终量

5、用mm微孔滤膜滤过消毒。

其它常用液

消化液：分离组织和分散细胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液。可以单独使用，也可以混合使用。

1）胰蛋白酶溶液

胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存

胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。胰酶溶液在，温度为37℃时，作用能力最强。注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’平衡盐溶液配制成%溶液。

胰蛋白酶溶液配制：

（1）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks平衡盐溶液（左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；

（2）次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为%或%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH至左右。

保存条件：-20℃冰箱中，以免分解失效。

EDTA·4Na溶液

EDTA是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离觧作用，而且毒性小。

常用工作液浓度为%。通常与%的胰蛋白酶溶液按1：1混合使用（混合液）。

注意：使用EDTA处理细胞后，一定要用Hanks液冲洗干净，因残留的EDTA会影响

细胞生长。

EDTA溶液配制：用无钙、镁的D-HBSS平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，

室温或4℃冰箱保存。

胰蛋白酶–EDTA·4Na溶液

（%胰蛋白酶,EDTA·4Na）

胰蛋白酶＋·4Na＋1LD-HBSS。-20℃冰箱中保存。

pH调整液

（1）NaHCO3溶液

常用浓度为%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌，分装，4℃冰箱或室温保存。

当pH值超过后，可用高压灭菌的10％醋酸溶液或通入CO2气体方法调节。

（2）HEPES（分子量）溶液

HEPES使用终浓度一般为10-50mM,但通常配成1M储存液：用200ml双蒸水溶解

克HEPES，用1NNaOH调节pH至然后过滤除菌，分装小瓶，室温或4℃保存。

抗生素溶液：

青霉素100单位/ml培养液

链霉素100mg/ml培养液

玻璃器皿的清洗

玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤

（1）浸泡：需先用清水浸泡。然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的

杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称

为浸酸。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。

清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）

（A）强清洁液63∶1000∶200000

（B）次强清洗液120∶200∶1000

（C）弱清洁液100∶100∶100。

配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发。

清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。

（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸后都必须用水充分冲洗。

胶塞的清洗

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。

塑料制品的清洗

必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，

最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

消毒

消毒方法分为三类：物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等），化学灭菌法（各种化学消毒剂）和抗生素。

（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线

直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外

线灯应距地面不超过米，且消毒物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。

（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。

在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气

阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。

常用物品消毒压力及时间：

培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃,15磅,20分钟；

布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃,15磅,20分钟，然后在烘箱中烘干；

。

（3）干热消毒：玻璃瓶，干热灭菌170℃,4小时

（4）滤过消毒：

（4）化学消毒法：最常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。

基本培养技术

一、培养操作基本要领和要求

1、无菌操作

2、培养前准备

（1）操作野消毒

（2）洗手和着装

（3）火焰消毒

3、培养操作

基本培养操作技术

（一）取材

（二）组织的分离

1、离心分离法：培养物为血液、腹水、羊水等可采用离心分离法

在分离淋巴细胞进行培养时可采用分层液进行分离。

2、机械分离法

（1）切割分离法

（2）机械分散法

*3消化分离法

（1）胰蛋白酶消化法

浓度常用%,C消化.37

(2)胶原酶消化法

适用于消化纤维组织、上皮组织以及癌组织等，不受钙镁离子的影响，终浓度常为

(3)EDTA消化法

(三)细胞计数法

(四)细胞的冻存

冷冻保存要点：（1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30－60分

钟；然后转入-20℃，放置30分钟；然后再转入-80℃放置16－18小时（或过夜）；最后放

入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1到-3℃速度降温，一直

到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存。

（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。

（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血

清浓度大于20％。

（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用

的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO能诱导HL-60细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。

特别注意：（1）细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。

（2）DMSO稀释时会释放大量热量。因此，DMSO不能直接加到细胞液中，必须事先配制。

（3）DMSO必须是细胞培养级别的。新买的DMSO本身处于无菌状态，第一次开瓶后应

立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO的尼龙滤膜。

细胞冷冻保存液主要成分：冷冻剂，基础培养液，血清或蛋白。

常用细胞冷冻保存液：（1）10％DMSO＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）

（2）10％甘油＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）

操作程序

(1)细胞:选对数生长期的细胞

(2)计数:细胞密度5106/ml

(3)冻存液培养液9份+DMSO1份加入细胞内

(4)分装:每安瓶.

(5)封口

冻存

细胞解冻与复苏

冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入

37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3分钟）。

（2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，

而且动作要轻。

。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml冻存细胞液加入到25－30ml新鲜完全培养液中），24小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液，以去除DMSO。如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。

特别注意：（1）解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。，要带手套，用镊子将细胞冷冻管

从液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。

（2）冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。

解冻冷冻保存细胞的离心方法:

(1)从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中快速解冻。

（2）将1－2ml冻存细胞液加入到25ml新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。

（3）用1000转离心2－3分钟，弃上清液。

（4）用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。

（5）接种细胞到培养瓶中，起始密度为3×105/ml。

常规的培养法

原代培养法

仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶或培养板、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：胎鼠或新生鼠试剂：DMEM培养基（含20%小牛血清），%胰酶，Hank’s液，碘酒

操作步骤（一）胰酶消化法1、将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入5—6倍的%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离

5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9、加入培养液l—2ml（视细胞量），血球计数板计数。10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

注意事项

1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。五、无菌操作的几个注意事项1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

无菌操作的几个注意事项

1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

传代培养法

细胞生长增殖形成单层后进行传代

1、吸除培养瓶内旧培养液

2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液，以能覆盖平底为限。

3、显微镜下观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大，立即终止消化

4吸出消化液，加入Hanks液吹打

5计数细胞

传代时注意事项

1、把握好传代时机，在80%-90%汇合阶段最好

2、消化时间要适度

3、消化液浓度要适宜

细胞培养的污染、检测和排除

污染途径

1、空气

2、清洗消毒

3、操作

4、血清

5、组织

污染对细胞的影响

一、真菌污染

二、细菌污染

三、支原体污染

微生物污染的排除

一、抗生素除菌法

二、加温除菌法（除支原体）

三、动物体内接种除菌法

四、巨噬细胞吞噬法

正常细胞和组织的培养

一、上皮细胞培养上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。

体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。

表皮细胞培养

1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成－1平方厘米小块。2、置%EDTA中，室温，5分钟。3、换入%胰蛋白酶中，4℃过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置%胰酶中，37℃，30—60分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。

二、内皮细胞培养

1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

神经胶质细胞培养

神经细胞（神经元〕不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，

获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数并调整细胞密度。5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以%胰酶消化处理。

肌组织培养

（－）骨骼肌细胞培养

1、出生1一2天的乳鼠，引颈处死。2、无菌取大腿肌组织，切成一小块后，用不含钙镁离子的Hanks液配的%胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。3、计数调整细胞密度。4、快接种量2×106/皿入培养基培养。5、培养基内含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促进分化。接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，细胞生长开始呈纺锤形，培养50－52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。

巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、、等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，

1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

7、小心拔出针头，把液体注入离心管。8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10mlDMEM培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用DMEM液冲洗1一2次，再加新DMEM培养液置CO2温箱中。无菌操作基本技术

1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%

ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每

次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间

污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间

隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可

以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦

拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操

作。

3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打

开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，

尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒

感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程

中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐

针头之伤害等。

5.定期检测下列项目：

.CO2钢瓶之CO2压力

.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300

小时/预滤网，3000小时/HEPA)。

6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。实验用品

1.种类︰

.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌

制品。

.TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,

plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。

.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

.塑料离心管:15ml,50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene(PP)为不透

明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。

.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。

.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml

2.清洗︰

.新购玻璃血清瓶先以~NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。

.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干

净，勿加清洁剂清洗。

3.灭菌︰

.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121oC,15lb,20分钟，置于

oven中烘干。

.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170oC,4小时。

.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高

压灭菌121oC,15lb,20分钟处理。培养基

1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温热。

2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，

可以再添加适量glutamine。

3.粉末培养基配制(以1升为例)：

.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为

-。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成

pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，

然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生

长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

.材料：

纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)

粉末培养基

NaHCO3(SigmaS-4019)

电磁搅拌器

无菌血清瓶

或mm无菌过滤膜

pHmeter

真空帮浦

CO2气体

.步骤：

取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。

称取适量之NaHCO3粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml

milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。

将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后

溶液之pH应为，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。

若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，

pH会升高。

以或mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养

基种类、日期、瓶号等，贮存于4oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤)

配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

4.配制培养基之生长测试

.材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

.步骤：

以待测试培养基培养MDCKcell，接种MDCK细胞于6-wellplate(或35

mmTCdish)中，每个well接种1×102活细胞，同时作对照组实验。

接种5～7天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群

落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。

去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室温下静

置10min。

去除固定液，水洗二次。

加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

去除染液，水洗二次。

以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不

佳，则丢弃之。抗生素

1.细胞库之细胞培养基不加抗生素

.培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。

.培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素，待

tokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。

2.寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin100units/ml+

streptomycin100ug/ml)。

3.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制

mycoplasma生长。

4.去除细菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin

250ug/ml,bacitracinunits/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。

5.抗生素使用种类与浓度：

工作浓度.储存温度.杀灭细菌

penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteria

streptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

chlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

gentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasma

amphotericinBug/ml-20℃yeastandmolds

nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds

fungizoneml-20℃yeastandmolds血清

1.血清必须贮存于–20～-70oC，若存放于4oC，请勿超过一个月。如果一次无法用完一

瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，

必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加

入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3.瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):-20oC或–70oC至4oC冰箱溶解一天，至室

温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇

晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20oC直接

至37oC解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4.heat-inactivation是指56oC,30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均

匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建

议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：

cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsand

platelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecell

type。

5.勿将血清置于37oC太久，若在37oC放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较

不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。

6.血清之沈淀物

.凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性

及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本

身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上

清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会

阻塞过滤膜。

.显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。

有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清

放在37oC中欲培养此“微生物“，但在37oC环境下，又会使此沈淀物增多，更

会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此

小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批

号的血清。

7.血清之生长测试

.材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

.步骤：

以a-MEMwith10%FBS(已测试过)培养MDCK细胞于T75flask至80

%confluency。

以trypsin-EDTA处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM制成细

胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM稀释细胞浓度为1×102活

细胞数/ml。

将1ml细胞悬浮液接种入6-wellplate中，并另加入1ml含不同浓度的血

清(20%,10%,4%,2%,1%,%)之a-MEM，使血清最终浓度为10

%,5%,2%,1%,%,%。用已测试过之血清同时进行对照组试验。

37oC，5%CO2培养箱培养5-7天，期间不需更换培养基，待细胞群落大

到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。

去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇:冰醋酸﹦3:1)，室温下静

置10min。

去除固定液，水洗二次。

加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

去除染液，水洗二次。

以肉眼计数群落数

计算SPE(SerumPlatingEfficiency)：

SPE=(no.ofcolonies/well)/100x100%

计算RPE(RelativePlatingEfficiency)：

SPE=[totalcoloniesofsixwell(test)/Totalcoloniesofsixwell(control)]x100%

.比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。

.订购多量同一批号的优良血清，置于–70oC保存之冷冻细胞活化

1.冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死

亡。

2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生

单株抗体或是其它蛋白质)。

3.材料

37oC恒温水槽

新鲜培养基

无菌吸管/离心管/培养瓶

液氮或干冰容器

4.步骤：

操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时

盖子易松掉。

将新鲜培养基置于37°C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无

菌操作台内。

取出冷冻管，立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全

部融化，以70%ethanol擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

取出ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为

1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取ml解冻细胞悬浮液作

存活测试。

解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，

一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞

悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清

液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。细胞传代培养

1.细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6，依细胞

种类而异。

2.材料：

.无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,

GibcoBRL21600-010)

.trypsin-EDTAsolution%EDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：

以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20oC，使用前放在37oC水槽

回温。

.新鲜培养基

.无菌吸管/离心管/培养瓶

3.步骤：

.附着型胞(adherentcell)

吸掉旧培养液。

用D-PBS洗涤细胞一至二次。

加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37oC作用数分钟，于倒

立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶

液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清

之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液。)

轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数

次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常

培养条件培养。

.悬浮型细胞(suspensioncell)

吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的

培养瓶中，以正常培养条件培养。

.融合瘤(hybridoma)

有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可

能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基

稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。细胞计数与存活测试

1.原理：

.计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

.血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，

其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为mm。当chamber上方

盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2xmm=x10-4ml。使用时，计

数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞

数目。

.存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细

胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细

胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。

2.材料：

.%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

.Erythosinbluishstain

取gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及grampreservativemethyl

paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline

.血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)

.计数器(counter)

.低倍倒立显微镜

.粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)

3.步骤：

.取50ml细胞悬浮液与50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于

小离心管中。

.取少许混合液(约15ml)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于

100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin

bluish)。

.计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue

等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线

上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

4大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml

*每一大格的体积=xx=10-4ml

.若不用血球计数盘，可用Coultercounter作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细

胞。

.范例：

T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取ml溶液与trypan

blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之

细胞数目。

活细胞数/方格：55,62,49,59

死细胞数/方格：5,3,4,6

细胞总数=243

平均细胞数/方格=

稀释倍数=2

细胞数/ml：x104x2=x106

细胞数/flask：x106x10ml=