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饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王莹、郎乐、张庆波、韩冰雪、李媛媛、王庆峰。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义4原理5试剂a)上游引物：5'-GGCTACACCGAGGACGACAT-3’b)下游引物：5'-CCCGCCTTAGCATCGAAGA-3’2脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。5.4真菌基因组DNA提取纯化试剂盒。5.510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化钾(KC1),15mmol/L氯6.1实时荧光PCR仪。6.11涡旋混合器6.12实时荧光PCR反应管。7.2DNA提取3——Ct值≥40.0,可判定样品实时荧光PCR结果为阴性，可直接报告未检出构巢曲霉；——Ct值≤35.0,可判定样品实时荧光PCR结果为阳性，按附录A进行确证。确证试验结果为构9生物安全措施410.1检验过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。10.2检验过程中防止交叉污染的措施按照GB/5A.1.1显微镜：10×~100×。A.1.5放大镜。A.2试剂苯酚10g,乳酸(密度1.21kg/m³)10g,甘油20g,蒸馏水10mL。将苯酚在水中加热溶解，然后A.3.1制片取载玻片加乳酸-苯酚液一滴，用接种针取一小块霉菌培养物(尽量是纯培养物),置乳酸-苯酚液A.3.2镜检A.3.3构巢曲霉形态特征小梗双层，梗基(5μm~6μm)×(2μm~3μm),小梗(5μm~6μm)6粗糙，直径3μm~3.5μm。闭囊壳球形，暗紫红色，直径135μm~150μm。子囊孢子双凸镜形，紫红色，约5μm×4μm,有两个鸡冠状突起。闭囊壳外面包围着一层壳细胞，淡黄色，球形，壁厚，直径约25μm

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