(高清版)DB22∕T 1978-2013 野鲤种质鉴定 微卫星法　

野鲤种质鉴定微卫星法2013-12-18发布2013-12-31实施吉林省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省水利厅提出并归口。本标准起草单位：吉林省水产科学研究院。本标准主要起草人：郑伟、闫春梅、毛瑞鑫、陈伟强、王战蔚、王文兰、杜晓燕、李忠强、李秀颖、常淑芳、李永利。14原理5试剂25.2无水乙醇。5.4TaqDNA聚合酶：-20℃保存。5.5分子量标准(Markers):DL2000。5.6溴化乙锭(EB)。5.9300g/L丙烯酰胺溶液：20mL水中融解29g丙烯酰胺，1g甲叉双丙烯酰胺，定容至100mL,4℃5.105×Tris硼酸(5×TBE)电泳缓冲液：Tris27g,硼酸13.75g,加蒸馏水400mL溶解后，加入0.55.11100g/L过硫酸铵：8mL水中溶解1g过硫酸铵，加水至10mL,4℃保存，现用现配。5.121g/L硝酸银(AgNO₃)染色液：将AgNO₃0.5g溶于超纯水450mL,加ddH₂O定容至500mL,5.13裂解液：5g/L十二烷基肌胺酸钠，10mmol/LEDTA(5.15提取液：Tris饱和酚+氯仿+异戊醇(25+24+1,体积比)。5.16乙醇溶液：乙醇+水(7+3,体积比)。5.20微卫星引物：参见附录A。6仪器6.1电子天平：精度0.0001g。6.4水浴恒温震荡器：温控范围RT-100℃,控温精度±1℃。6.8凝胶成像分析系统。38试验步骤取20mg鳍条加入0.6mL裂解液，55℃温育1-2h,并不时轻摇至组织块完全消化，取上清液用提取液抽提3次，加入无水乙醇1ml于-20℃过夜沉淀，离心，弃去上清液，再用0℃预冷的乙醇溶液洗涤1次，自然干燥后加50-100μL1×TE(pH8.0)溶解DNA,4℃保存备用。8.2.1DNA纯度测定吸取1-3μL提取的DNA,用浓度10-20g/L琼脂糖凝胶100V电泳30min,检测所提取DNA的质量。以DNA条带的分子量及有无拖尾为标准判断DNA的质量。分别于260nm波长和280nm波长下测定产物(或产物稀释液)的紫外吸收值。确定Azgo/A₂s比值在1.8-2.0范围内，方可正常进行后续实验。8.2.2DNA浓度测定取适量8.2.1测定后产物，于260nm波长测定紫外吸收值，并根据公式(1)计算产物DNA浓度。L比色池厚度，单位为厘米(cm);稀释倍数检测前DNA吸光度值达到允许范围0.1-0.8时所需要稀释的倍数。8.3微卫星引物配制取附录A所列17种微卫星引物用水配制成浓度为50pmol溶液，4℃保存备用。8.4.1PCR反应体系PCR反应体积均为15μL,PCR反应体系组成见表1。4反应体系正向引物(2pmol/μL)反向引物(2pmol/μL)8.4.2PCR反应程序表2微卫星标记——PCR反应程序阶段温度时间1230个循环348.5PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶检测58.5.3制胶将配制的52mL300g/L丙烯酰胺溶液中加入40mL5×TBE和107mL蒸馏水，15μLTEMED,用搅棒混匀溶液(不得有气泡),将制好的胶板斜放45度角，然后用玻棒引流缓缓灌缓慢移去胶板底端的塑料封口槽，将胶板带凹口面向内装到电泳槽上，用弹簧夹夹紧胶模。用1×加完后，在预留的样品槽点入DL2000markers,将电源连接，120V恒压电泳。当指示剂跑到胶板底部时，结束电泳，将电源电压调至为“O”,再关闭电源开关。取下凝胶板心去掉胶板两侧的隔板后在蒸馏水中轻轻撬开两片玻璃板取下凝胶，用蒸馏水洗胶30s,再将凝胶置于1g/L硝酸银染色液中染色10min,型(如AA,AB,AC或BB等),建立各个群体的等位基因型数据阵列。8.7.2结果分析利用群体遗传学分析软件