DB15-T 3747-2024 羊布鲁氏菌免疫抗体(M5-90△26株)与感染抗体鉴别检测ELISA法

15ELISAmethodfordistinguishingm5-90Δ26vaccinatedI本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC1本文件起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中1羊布鲁氏菌免疫抗体(M5-90Δ26株)与感染抗体鉴别检测ELISA法本文件规定了仅免疫羊布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90Δ26株）免疫抗体与感染抗体鉴别检测GB/T6682分析实验室用水规格GB/T18646-2018动物布鲁氏菌病NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范ELISA酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImHRP辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidasTMB3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TetramethylbenzPBS磷酸盐缓冲液（PhosphaPCR聚合酶链式反应（PolymeDNA脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacBCA聚氰基丙烯酸正丁酯（BicinchoninicAci25.3恒温培养箱（37℃)。5.5冰箱（4℃,-20℃)。5.6旋涡振荡器。6.14血清稀释板。6.15封板膜。6.16移液器相匹配的吸头。6.17商品化试剂盒（可以选择）。按照NY/T541执行，按常规方法采血，采血管室温（18℃~25℃)下倾斜30°静置2h～4h，待r/min离心10min～15min收集血清。样品采集生物安全规范7.2样品保存血清样品若在一周内进行检测，则置于4℃冰箱保存备用。血清样品若超过一周检测，则置于-7.3样品运输血清样品若12h内运达实验室，在保温箱内加冰袋运输。若超过12h后 (-20℃)后，在保温箱内加大量冰袋运输，途中不能超过48h，样品的包装和运输应符合农业农村3感染抗体，指若羊感染布鲁氏菌野毒株，则既会产生针对脂多糖LPS的抗体，也会产生针对膜间质蛋白BP26的抗体。免疫抗体，指若羊免疫布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90Δ26株）以后，则只产生针对脂多糖LPS的抗体。鉴别ELISA检测方法，通过同时检测羊血清样品中脂多糖LPS和膜间质蛋白BP26的抗体，以鉴别羊布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90Δ8.2试剂平衡试剂在室温（18℃~25℃)条件下放置至少30min，平衡至室温（18℃~25℃)后使用，使用8.3试剂配制8.4稀释充分混匀。置2℃~8℃保存备用。μL加入96孔酶标板中，标记为膜间质蛋白BP26和脂多糖LPS包被板，贴封板膜，置2℃~8℃作用16h～18h。膜间质蛋白BP26包被板标记为B1、B2……，脂多糖LPS包被板标记为L1、L2……。按照附录B8.6洗涤8.9加样48.11洗涤8.12加酶结合物8.13孵育8.14洗涤8.16终止8.17测定若LPS/LPS＞2.1，且BP26/BP26＞2.1时，则判为试验成立。否则，本次试验无效，S/N值LPS=SLPS/LPS；S/N值BP26=S表示样品在脂多糖LPS包被板上的OD450nm值；SBP26，表示样品在膜间质蛋白BP269.3结果判定59.3.1若S/N值LPS＜3.1时，与S/N值BP26无关，则结果判定为阴性，表示没9.3.2若S/N值LPS≥3.1且S/N值BP26＜3.3，则结果判为脂多糖LPS抗体阳性，表示羊布鲁氏菌基6A.1抗原的制备从灭活的羊种布鲁氏菌M5株中提取核酸，应用PCR技术扩增编码膜间质蛋白BP26开放阅读框的753用蛋白纯化仪纯化重组膜间质蛋白BP26，取10μL膜间质蛋白BP26进行SDS电泳，对蛋白纯度和分子量进行测定，纯化重组膜间质蛋白BP26大小约26kDa，无其他明显杂带，蛋白较为纯净。BCA方法测定重组膜间质蛋白BP26的浓度达到0.5mg/m脂多糖LPS的提取，按照GB/T18646-20加蒸馏水定容至1000mL。121℃,30min高压灭菌，置2℃~8℃保存备用。节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1000mL。121℃,30min高压灭菌，置2℃~8℃保存备用。称取10g明胶，加入800mLPBSmL。过滤除菌，置2℃~8℃保存备用。称取58g磷酸氢二钠（含12个结晶水）、4g磷酸二氢钾、160g氯化钠、4g氯化钾，溶于800mL蒸馏水中，再加入10mL吐温-20，最后加蒸馏水定容至1000mL。121℃,30min高压灭菌，置2℃~A.6样品稀释液称取50g脱脂奶粉、0.5mL吐温-20最后再加PBS定容至1000mL。过滤除菌，置2℃~8℃保存备用。A.7酶结合物将商品化HRP标记的驴抗山羊和HRP标记的驴抗绵羊酶标抗体，按照1:1混合后，