DB51T 2910-2022 鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程　　

CCSB52DB51四川省市场监督管理局发布I 2 2 2 2 2 4 4 5 6文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规本文件主要起草人：刘亚、龚全、赖见生、吴晓雲、陈叶雨、宋明江、杜军、刘光迅、周1鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程2规范性引用文件GB/T4789.28-2013食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量GB/T6682-2008分析实验室用水规格和实GB/T18652-2002致病性嗜水气单胞菌检SC/T7013-2008水生动物产地SC/T7014-2006水生动物检鲟鱼类志贺邻单胞菌病Plesiomonasshigelloidesfors检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照GB/T4789.28、GB/T18652和SC/T7014规定执行，Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg2+），DNA分子量标准参照物选用专业试剂公司提试剂；微生物生化鉴定管可替代相应鉴定培养基或鉴定试剂，上述未提及的见附4.2水2学显微镜、PCR扩增仪、电子天平、微量移肝脏肿大充血，出血；部分病鱼肠道肠腔内有少量淡黄9.1革兰氏染色9.2生理生化试验9.2.2氧化酶试验39.2.3吲哚试验按SC/T7014表2的吲哚（靛基质）试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为9.2.4糖、醇类（葡萄糖、甘露醇）发酵试验将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A.2），28℃培养24h后观察。培养基9.2.5运动性试验养36h-48h。若待检菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性酚氯仿法、高盐法或采用商用试剂盒提取细菌基因组D9.3.3琼脂糖凝胶电泳用TAE电泳缓冲液（A.3）配制1％的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹参照物作对照。120V电泳约20min-40min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察，并在长波9.3.4PCR扩增产物纯化、测序、序列比对9.3.4.1PCR扩增产物纯化按每0.1g琼脂糖凝胶加0.1mL酚，将酚加入9.3.3在漩涡震荡仪上震荡1min-2min；14000r/min离心5min。取上体积的氯仿：异戊醇（24:1A.6混匀，12000r/min离心5min。向收集的水溶液中加入1/10离心10min，弃上清。将沉淀的DNA溶于适当体积9.3.4.2PCR扩增产物测序与同源性分析将上述纯化的PCR扩增产物进行序列测定4+--+++测定的16SrRNA基因序列与附录B所列的基因序列比较，同源性达试剂配方A.2糖、醇类发酵培养基溴百里酚蓝1％水溶液3mL（溴百里酚蓝先用少量95％乙醇溶解后，再加水配制在800mL双蒸水中溶解242gTris碱，加入57.1mL冰乙酸和37.2gEDTA，充分混匀后，加双蒸水定容至1L，室温保存。使用时，配成1×TAE电A.4溴酚蓝指示剂溶液6×上样缓冲液将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50A.5酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）A.6氯仿：异戊醇（24:1）将24体积的氯仿和1体积的异戊AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTAATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCCGCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCATGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAAGTTGAGCTCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTGCGAGTAACGTCAATGCCACTAGGTATTAACTAGTGACCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCAGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCGTGACTGGTCATTCTCTCAAACCAGTTAGAGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTGGGTTCGATAG