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1DB51DB51/T2469—2018鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程2018-04-18发布2018-05-01实施四川省质量技术监督局发布I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 5 6 91SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程2DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录HeartInfusion,BHIA.1）。28℃培养36h～48h后，挑取表面光滑、微隆起、针3按SC/T7014表2的乙酰甲基甲醇（V-P）试验的规定执行。培养基下层出现红色为阳性，不出现红9.2.7糖、醇类（L—阿拉伯糖、菊糖、核糖、乳糖、D-甘露醇、山梨醇6），震荡悬浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.7），10μL20mg/mL的蛋白酶K（A.8），混匀，37℃温育1h；加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.9），充分混匀，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.10）混匀，65℃温育20min；加入等体积的酚﹕氯仿﹕异戊醇（25:24:1）（A.11），混匀，12000r/min离心5min；取上清液加入等体积的氯仿﹕异戊醇（24:1A.12混匀，12000r/min离心5min；取42s1.0μL，引物(20μmol/L)P1-F和P1-R各1.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA补足至50μL。混匀后，3000r/min离心30s。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72用TAE电泳缓冲液（A.13）配制1％的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液没胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液（A.14）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约20min，当溴酚蓝到9.3.4.1.4取上清液加入等体5---+----+---6 7将0.121gTris碱（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水将29.22gNaCl（分子量58.444.1gNaCl溶解于80mL双蒸水中，缓将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE在400mL双蒸水中溶解121gTris碱，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加双蒸水定容至8将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴91cgcaagtgccaaaggtgttaaagaaaaaatcaattgtcctaacagttgatgcgataatggctttgttttccctgttggaggaaaaacaatggactatgtttataaaagatgcctttcgtgctttagaagctggagagccttagcatctggtgcagat

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