2025届高三生物一轮复习课件：基因工程

基因工程基因表达载体一轮复习课件一、基因工程及基因工程的基本工具1．基因工程的概念基因工程的别名____________技术操作环境____________操作对象基因重组DNA

生物体外操作水平____________水平基本过程剪切→________→________→表达结果人类需要的新的生物类型或____________优点①可_____________生物的遗传性状；②可克服远缘杂交不亲和DNA分子拼接导入生物产物定向改造原理：基因重组2．基因工程的基本操作工具原核生物磷酸二酯键黏性末端磷酸二酯键黏性末端平末端目的基因质粒自我复制切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端。①黏性末端：是限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的(错位切)，如下图所示：②平末端：是限制酶在识别序列的中轴线切开时形成的(平切)，如下图所示：思考：1.在切割目的基因和载体时要求用

限制酶，目的是产生相同的

。同一种黏性末端2.将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切

处，同时产生

个黏性末端。两4思考：限制酶与DNA连接酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是：(2)限制酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。磷酸二酯键项目种类限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解酶)解旋酶作用底物DNA分子DNA分子

片段脱氧核苷酸

DNA分子DNA分子作用部位3.与DNA分子相关的几种酶的比较磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键磷酸二酯键项目种类限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子4.选择限制酶的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用

和

两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。如图甲可选择

。如图甲不能选择

。PstⅠSmaⅠPstⅠEcoRⅠ(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。①切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。②目的基因的表达需要调控序列，质粒插入目的基因部位之前有启动子，之后需有终止子。③质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。[考向预测]图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ四种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依a次由____________________________连接。(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是______末端，其产物长度为______________________________。脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖平537bp、790bp、661bpMspⅠBamHⅠMboⅠSmaⅠC↓CGGG↓GATCC↓GATCCCC↓GGG(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有____种不同长度的DNA片段。4MspⅠBamHⅠMboⅠSmaⅠC↓CGGG↓GATCC↓GATCCCC↓GGG(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是______。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_______的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是_________

______________________________________。

BamHⅠ抗生素B向连接同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反MspⅠBamHⅠMboⅠSmaⅠC↓CGGG↓GATCC↓GATCCCC↓GGG【解析】(1)两条脱氧核苷酸链之间的碱基通过氢键相连，一条脱氧核苷酸链中相邻的碱基通过“脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖”连接。(2)根据限制酶SmaⅠ识别的碱基序列可知，限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端。在图1序列中共有2个SmaⅠ的切割位点，切割后形成3种不同长度的产物，分别为537bp、790bp、661bp。(3)图1中有SmaⅠ的两个识别序列，完全切割后产生3个不同长度的DNA片段，若虚线方框中的碱基对被T—A碱基对替换，再经SmaⅠ识别并完全切割后会产生2个DNA片段，其中1个DNA片段与未替换前完全切割的相同，因此经完全切割后共产生4种不同长度的DNA片段。(4)切割目的基因可选用限制酶BamHⅠ和限制酶MboⅠ，但限制酶MboⅠ可将质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都破坏，而限制酶BamHⅠ只破坏抗生素A抗性基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ；重组质粒中含有抗生素B抗性基因，因此可在含抗生素B的培养基上培养。二、基因工程的基本操作程序及应用1．基因工程的基本操作程序基因文库PCR启动子标记基因农杆菌转化显微注射PCR抗原—抗体杂交（我国科学家独创）2．利用PCR获取和扩增目的基因DNA半保留复制

PCR扩增仪(PCR仪)耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸（2种）（DNA聚合酶需要Mg2+激活）PCR技术基本过程3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链B.复性（退火）当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合C.延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’变性复性延伸PCR技术第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮循环的产物完成后，常采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳（1）引物是一小段能与

的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸。DNA母链的一段碱基序列互补配对（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是

。引物与目的基因模板链的

端结合。从子链的5′端向3′端延伸3′【拓展练习】3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物3’5’DNA母链（3）PCR过程中需要加入两种引物，原因是？（4）两种引物的要求？（理解）DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，不能从头合成，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。①引物自身不能环化②两种引物之间不能互补配对③引物长度不宜过短，防止引物随机结合

3.基因表达载体的构建——最核心步骤启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游,是

识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出

，最终获得蛋白质。终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游，能终止mRNA的转录标记基因的作用：RNA聚合酶启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点mRNA

和

出含有目的基因的受体细胞。使目的基因在受体细胞中

存在,并可以

给下一代,并使目的基因能够

和

作用。

①目的:②基因表达载体的组成：稳定遗传表达发挥鉴别筛选构建过程(1)利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系细胞器知识，结合基因工程操作程序的基本思路，可以用大肠杆菌生产人的糖蛋白吗？(2)启动子＝起始密码子吗？终止子＝终止密码子吗？(3)目的基因的插入位点是随意的吗？不可以。糖蛋白上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，大肠杆菌中不存在这两种细胞器。启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间深挖教材4．将目的基因导入受体细胞

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体的DNA上。P81原理：花粉管通道法（我国独创）②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。方法：实例：我国“转基因抗虫棉”5．目的基因的检测与鉴定例：逆转录耐高温的

DNA聚合对位练习：为确定转基因耐盐碱水稻是否培育成功，可用

方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐碱性。经检测，科研人员发现部分获得耐盐碱基因OsMYB56的水稻幼菌不具有耐盐碱能力，原因可能是_________________。一定浓度的盐水浇灌虽然获得了相应的基因，但耐盐基因OsMYB56转录或翻译异常(或耐盐基因OsMYB56表达异常)[考向预测]1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存和表达。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。注：普通大肠杆菌菌落为乳白色，LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal产生蓝色物质。请根据以上信息回答下列问题：(1)从动物体内获取细胞进行培养时，除了细胞需要的各种营养物质和适宜的温度、pH和渗透压外，还需要满足的环境条件有_____________________、________________。

(2)利用PCR可以在体外扩增含该目的基因的DNA片段，其扩增循环一般可以分为_________、_________、__________三步。(3)为了确保目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以便定向克隆和成功表达，可以采用________________________的方法。

无毒、无菌的环境适宜的气体环境变性复性延伸(用不同的酶)双酶切切割目的基因和载体(4)在完成第④步操作后，菌液中大肠杆菌分为未转化、导入空白质粒、导入重组质粒三种，它们在图中培养基中培养后观察到的结果分别是___________、_____________、______________。

没有菌落蓝色菌落乳白色菌落某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存和表达。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。注：普通大肠杆菌菌落为乳白色，LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal产生蓝色物质。【解析】(1)结合分析可知，从动物体内获取细胞进行培养时，除了细胞需要的各种营养物质和适宜的温度、pH和渗透压外，还需要满足无毒、无菌的环境和适宜的气体环境(95%空气+5%CO2)。(2)PCR可以在体外完成目的基因的DNA片段的扩增，其扩增循环一般可以分为变性、复性、延伸三步，需要的温度条件依次为高温、低温和中温。(3)为了确保目的基因与载体的连接发生定向连接，防止发生自身环化和插入方向错误，导致无法定向克隆和成功表达。可以通过用两种不同的酶切割出具有不同末端的运载体和含有目的基因的DNA片段，而后通过DNA连接酶的作用实现目的基因和运载体的正向连接。(4)未转化的大肠杆菌不含AmpR，不能在含有青霉素的培养基中形成菌落，空白质粒含有完整的LacZ基因，其编码产生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal产生蓝色物质，导致该大肠杆菌菌落呈现为蓝色；目的基因插入到LacZ基因中产生的重组质粒，没有完整的LacZ基因，不能发生颜色变化，大肠杆菌菌落表现为正常的乳白色。1．概念理解(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。(2)操作：________或合成基因。(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出____________。(4)目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对______________进行设计改造。改造新的蛋白质蛋白质结构三、蛋白质工程

功能蛋白质结构氨基酸序列脱氧核苷酸序列(基因)2．蛋白质工程的设计流程蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传深挖教材(2024年广东校联考模拟预测)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：(1)由于密码子具有

，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。

(填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”)法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。

简并性AB和BCA

(2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶

的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5‘________________________3'。

-CTCGAG

XhoⅠ和MunⅠCCTTTCAGCTCA-(3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经

(处理方法)，大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选出

色的菌落即为工程菌种。

Ca2+处理法白

(4)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发→

→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

设计预期的蛋白质结构【解析】(1)AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，由于密码子具有简并性，所以AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。胰岛素基因存在于所有细胞中，但只能在胰岛B细胞中表达，结合题意“BCA法是利用胰岛B细胞的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段”可知，BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA；在基因的结构中，启动子在非编码区，是不会被转录和翻译的，根据题干信息“AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素”，故由AB法中的“胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列”，和BCA法中的“胰岛B细胞中的mRNA”得到的目的基因中均不含人胰岛素基因启动子。(2)根据图2，对于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoⅠ和MunⅠ和EcoRⅠ中选择；同时质粒上EcoRⅠ的其中一个作用位点是在标记基因上，所以只能选择XhoⅠ和MunⅠ两种限制酶，则需要在设计PCR引物时可添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列。已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，在设计PCR引物时需要添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列，根据两种酶在质粒上的位置上可知，XhoⅠ的识别序列需要添加在目的基因左侧、MunⅠ的识别序列需要添加在目的基因右侧，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，由于DNA合成时，新链的延伸方向是：5'→3'，即其中一种引物与模板链3'端(①处互补的位置)碱基互补配对，同时该引物序列需要包含XhoⅠ的识别序列，所以其中一种引物设计的序列是5'-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3'。(3)将目的基因导入微生物细胞常用的方法是钙离子处理法，使其处于感受态，目的基因的插入位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。(4)蛋白质工程的途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。节选（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是______________________，物质b是_______。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________。

氨基酸序列多肽链mRNA

密码子的简并性(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是_________________。种类

和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏提取的水蛭蛋白的酶解时间酒精溶液蓝四、DNA的粗提取和鉴定1.实验原理：2．操作流程新鲜洋葱酒精二苯胺(溶解并提取DNA)[考向预测]考查DNA的粗提取和鉴定(素养目标：科学探究)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。(1)图中实验材料A可以是______________等，研磨前加入的B应该是__________。

(2)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2mol/L的NaCl溶液的目的是____________________。

洋葱(或菜花)研磨液使DNA溶解(4)DNA鉴定的原理是________________________________。在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色(3)在该实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如下表所示的4种滤液，其中含DNA最少的是滤液________。

1B液中搅拌研磨后过滤滤液E22mol/L的NaCl溶液中搅拌后过滤滤液F30.14mol/L的NaCl溶液中搅拌后过滤滤液G4冷却的95%的酒精溶液中搅拌后过滤滤液HH【解析】(1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入研磨液，进行充分的搅拌和研磨。(2)DNA在2

mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14

mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向滤液中加入2

mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质。(3)DNA不溶于冷酒精，可利用这一原理进一步提纯DNA。【例】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此分析，不合理的是

（

）A．PCR产物的分子大小在250～500bp之间B．3号样品为不含目的基因的载体DNAC．9号样品对应植株不是所需的转基因植株D．10号确定反应体系等对结果没有干扰B[自主学习]五、生物技术的安全性和伦理问题经济发展水平安全性生殖不赞成不支持基因检测基因歧视致病菌不生产试管婴儿和设计试管婴儿的比较

(1)不同点①所用技术手段：设计试管婴儿胚胎移植前______(填“需要”或“不需要”)进行遗传学诊断或基因诊断，试管婴儿______(填“需要”或“不需要”)进行遗传学诊断或基因诊断。

②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿主要用于白血病、贫血症的治疗。(2)相同点：_________________________________________________________________________________________________。

需要不需要

都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖深挖教材（2021年福建高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。引物1和引物4(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图乙所示。①选用_______酶将载体P切开，再用_________（填“T4DNA或“E·coliDNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。EcoRVT4DNA②载体P′不具有表达MT基因的___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。Ca2+启动子

终止子XhoI和PstI(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________________________________________________。尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定考题重现1.(2024年广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。(1)研究者优化了培养基的

（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和BC膜的复合物）。碳源、氮源(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD（被工程菌RNA聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为

，理由是

。PT7、PBAD和PBAD

无活性物质(无活性T7RNAP)，蓝光照射时再激活基因1表达基因2、3可正常表达出(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为

（答两点）。(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是

。(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路

抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素将酪氨酸酶替换成合或其他色素的酶或将酪氨酸酶替换成合其他颜色蛋白。2.(2023年山东卷)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是

。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有___________________

______(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物

。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的

(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。

RNA聚合酶限制酶切割位点、标记基因、复制原点等F2和R1或F1与R2a链(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了

，条带2所检出的蛋白

(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。

J-V5融合蛋白不是【解析】(1)启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组后的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3'-5'，非模板链(也就是a链)是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5'-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3'-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测没有条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。3.(2022年山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______________________________________________，为使PCR产物能被限