次氯酸荧光探针的设计与合成

次氯酸荧光探针的设计与合成目录TOC\o"1-3"\h\u30701摘要 摘要：次氯酸/次氯酸盐(HOCl/OCl)是最重要的活性氧(ROS)之一，它们在许多生理或病理过程中都担当着不可或缺的角色。然而，低浓度或错误的定位可能会对生理功能产生不良影响且与某些疾病的发生有着密切的关联，所以，研究且开发用于OCl−检测的荧光探针具有重大的意义。本研究基于4-叔丁基-2,6-二甲酰基苯酚的结构设计，合成了一种新型荧光探针，用于检测次氯酸根的存在。关键词：荧光探针、次氯酸、光谱分析、离子响应1引言在我们日常的生次氯酸(HOCl)是体内重要的活性氧(ROS)之一，是各种生理和病理过程的关键指标REF_Ref8852\r\h[1-REF_Ref9515\r\h3]，在我们日常的生活环境以及生理体系当中，无论是生物大分子还是小分子化合物都扮演着十分重要的角色，它们与我们的日常生活是密切相关的，部分分子有着十分显然的毒性，而另一部分在我们的生理过程中起着不可缺少的作用。因此，我们开发用于检测环境和生命体中某些重要化合物的探针，已逐渐成为了分析化学科研人员研究的一个热点问题。荧光探针其具有较高的敏感性、低廉的成本、简易的操作及少量用样等等诸多长处，对于检测和分析应用具有很强的应用价值；同时，也得以广泛运用于生物医学和材料科学等领域。因此，合成设计出一个用于专门检测分析对象的荧光探针是一份十分具有挑战及意义的工作REF_Ref22931\r\h[4]。1.1荧光探针在生物学、医学领域以及环境检测领域，荧光探针是一个不可缺少的工具。荧光探针通常包括两个部分，分别是荧光团和检测基团，二者一起组合成荧光探针。荧光探针是一种高灵敏度的检测工具，其具有灵敏度强、特异性强等特点。其主要是利用物质能在低紫外线的照射下能发出荧光现象的原理，具体来说就是利用荧光探针特异性地与分析物相结合，在探针被聚合酶降解之后，将探针上的荧光基团从淬灭基团中去除，从而发出荧光。因此，我们可以通过测量荧光信号的强度和波长来判断分析物的浓度和性质。此外，荧光探针还含有荧光传感和示踪两种功能。其中，荧光传感侧重于分子识别与检测；而示踪则侧重于对某些特定生理过程的分析和特定结构的成像。1.2本论文的研究目的及意义次氯酸盐(OCl-)和次氯酸(HOCl)是生物体内重要的活性氧物质(ROS)。次氯酸(HOCl)在内的活性氧(ROS)一方面可以调节我们生物体的生理功能，另一方面，活性氧浓度异常会引起一系列生物大分子损伤，进而危害人类健康的方方面面。特别是它可能与癌症直接相关。且HOCl的扩散距离小于20μm在这样的距离内，内源性HOCl可以与其他生物分子和共存的抗氧化剂迅速反应。因此在原位和体内追踪该分子带来了极大的挑战。然而在过去的几十年里，通过不断的探索，荧光探针已被证明是实时可视化和分析生物系统中HOCl定位和动态代谢的不可缺少的工具，因为它具有高灵敏度、简单实现、实时检测和对生物样品的良好兼容性等优点REF_Ref5578\r\hREF_Ref5584\r\h[5-REF_Ref15361\r\h9]。近些年来，大量的次氯酸荧光探针被报道REF_Ref5578\r\h[10]，但由于其浓度相对较低，在正常细胞中特异性地追踪基础HOCl上仍然是一个非常大的挑战。因此开发高特异性和超灵敏的荧光探针来追踪基底线粒体次氯酸盐，对于揭示其在活细胞线粒体中的多种细胞功能非常重要REF_Ref15361\r\hREF_Ref15364\r\h[11]。而一般在生物样品中，对于检测荧光探针的性能要求较高。因此，构建具有快速、灵敏、高特异性的次氯酸探针对于实际应用具有重要的意义，同时也有助于对次氯酸的生理功能进行研究。1.3近年来次氯酸荧光探针的研究进展由于荧光探针具备易操作、特异、响应快速，且无需创伤性样品处理、在生物成像等方面应用广泛等优势，因此备受研究者所关注。近年来，研究者根据不同的识别基团和荧光团设计并报道了多种不同种类的次氯酸荧光探针REF_Ref26705\r\h[12]。对次氯酸进行基本鉴别的机制一般分为以下方面：首先是将氨基酚进行氧化反应以获得苯醌，此外，硫化合物的氧化以及对肟/亚胺的辨别以及内酯的环化及开环机制，也是常见的次氯酸辨识方式。REF_Ref24067\r\h[13,REF_Ref24074\r\h14]。下面简要介绍不同种类的次氯酸盐荧光探针:2010年，报道了基于硫螺内酯开环的次氯酸荧光探针1REF_Ref10514\r\h[15]。，此探针已成功开发为一种高灵敏度和选择性的荧光探针，用于成像生成的次氯酸在人类嗜中性粒细胞中，且发现该探针在其对HClO的荧光和发色反应中显示出“关闭-打开”切换，这暗示是由次氯酸诱导的硫代-螺环开环造成的。该探针在高灵敏度下表现出优异的性能，在生物pH条件下对次氯酸的选择性优于其他活性氧，具有快速反应性以及在光照下对自氧化的高度耐受性。该探针已成功应用于检测在人类嗜中性粒细胞中产生的HClO。图1基于硫螺内酯开环的次氯酸荧光探针12013年，报道了一种基于BODIPY的荧光探针2(HCSe)REF_Ref12833\r\h[17]，此探针可根据HOCl的量，由特定的HOCl促进的二苯基硒化物的氧化，快速检测次氯酸。使用RAW264.7细胞的共聚焦荧光显微镜成像表明，新型探针HCSe可以用作检测活细胞中HOCl的有效荧光探针。图2基于BODIPY的荧光探针22014年，报道了一种姜黄素类次氯酸的荧光探针3的检测特性REF_Ref13430\r\h[18]。实验细节表明，探针3作为一种优良的紫外可见和荧光选择性、灵敏度探针，可用于次氯酸的检测，而其他活性氧(ROS)和活性氮(RNS)对探针3的紫外可见光谱和荧光猝灭性能没有影响。一种可能的检测机制是HOCl将探针3的苯酚氧化成醌，从而产生非荧光的姜黄素衍生物。此外，还通过取消荧光来评估探针检测活细胞（HepG2细胞）中ClO-的能力。并举例说明了探针3在84消毒液中次氯酸盐定量分析中的应用。图3姜黄素类次氯酸的荧光探针32016年，报道了一例荧光探针4(NDMTC)。此探针用于HOCl对OCl-和其他生物活性分子的特异性测定。实验结果表明，NDMTC在皮摩尔水平上显示出了7.6pM的检测限，是首个成功检测HOCl荧光信号的探针。此外，为了实现药物对溶酶体的靶向，烷基morpholine基团被引入到NDMTC框架中，从而得到了一种新的衍生物Lyso-NDMTC。此衍生物在溶酶体细胞器中的荧光信号具有明显的显像HOCl的特性。利用综合背景抑制和深层组织穿透技术，成功实现了小鼠细胞内原生HOCl的可视化和肿瘤组织的识别，并且这一方法和成果为肿瘤治疗和生物医学研究提供了新的思路和方向。图4基于二甲氨基硫代甲酸酯的次氯酸荧光探针4及其衍生探针2020年，报道了一种基于双氰异异黄酮C=C键氧化的荧光次氯酸盐探针5(AI)。该荧光探针主要指在有氯化物存在的背景下，可被HOCl氧化的双键c和dc键部位进行检测。然而，由于探针的共轭结构容易出现断裂，导致荧光的发射出现了可猝灭或开启的现象。为了解决这一问题，设计HOCl荧光探针时，引入了丙二腈作为一种常用的钝化剂，既能有效地提高探针的抗荧光猝灭和开启的性能，又能激活探针，实现可靠的荧光发射检测。钝化活化调节了两个ICT(分子间电荷转移，ICT)过程，用于HOCl的比例荧光检测。高灵敏度、高精度的检测实现了在生物成像中的高效应用。图5基于醛肟氧化的近红外次氯酸荧光探针2021年，报道了噻吩酰肼的比率、比色次氯酸荧光探针6。此探针以香豆素为荧光团分子，合理地开发了一种新型化学传感器(CMTH)用于检测由C的氧化反应产生的比例反应和比色反应中的HClON键。进一步的分析结果表明，CMTH可以实现高灵敏度，检测限低(256nM，在同类产品中名列前茅)，并且可以对多种生物中的HClO进行高选择性(在一堆干扰分析物上)成像检测，且细胞毒性低，并且效果良好。细胞和组织的通透性也是如此。特别是，与迄今为止报道的其他荧光HClO探针相比，CMTH在对HClO的响应时间(<40s)方面表现出色，是同类产品中的佼佼者。此外，由于其优异的水溶性，CMTH还可以用于跟踪环境系统中的HClO。这是一种新型化学传感器CMTH，此探针作为比色和比例化学传感器，用于对水溶液，真核细胞，原核细菌和脊椎动物斑马鱼中的HClO进行高灵敏度和超快速成像检测。图6噻吩酰肼的比率、比色次氯酸荧光探针62022年，报道了本文报道了一种新的“关闭”线粒体可靶向NIR荧光探针7(NIR-ClO)REF_Ref25341\r\h[19]，用于在体外和体内对骨关节炎反应相关的HOCl水平进行特异性分析和成像。NIR-ClO荧光探针在存在HClO条件下呈现高灵敏度和选择性的荧光“开-关”响应特性，这是由于HClO特异性引起的HOCl诱导的C=C键断裂反应所致。该荧光探针的检测限(LOD)可达28.3nM，且具有高速响应能力(<60s)，因此可用于检测仿生条件下的HClO。此外，NIR-ClO还成功应用于活RAW264.7细胞和骨关节炎模型大鼠中HClO成像的研究工作。图7基于C=C键断裂的淬灭型次氯酸荧光探针71.4本论文的创新性本论文以4-叔丁基-2,6-二甲酰基苯酚和邻氨基苯酚为原料合成了中间产物HME，然后，又以中间产物HME和氨基硫脲为原料合成最终产物HMEI，最后通过核磁共振、液质联用质谱仪确定HMEI的结构。本研究成功合成了一种基于4-叔丁基-2,6-二甲酰基苯酚的全新次氯酸荧光探针HMEI，该探针能够在经过两步简单的反应后被合成得到。通过多种表征手段，我们确定了该探针的结构及其与次氯酸反应的机理，并对其离子响应性能和光谱响应性能进行了测试。此探针为后面次氯酸相关生物的研究提供了一个有效的工具。同时此探针HMEI对次氯酸生理功能的研究也起到了一定的帮助作用。2实验合成部分2.1目标分子的合成路线设计图8HME的设计合成路线图9HMEI的设计合成路线2.2实验仪器和试剂表SEQ表\*ARABIC1实验试剂试剂名称试剂纯度出产公司4-叔丁基-2,6-二甲酰基苯酚分析纯（AR）萨恩化学技术（上海）有限公司乙醇分析纯（AR）西陇科学股份有限公司哌啶分析纯（AR）广州化学试剂厂2-氨基苯酚分析纯（AR）上海阿拉丁生化科技股份有限公司石油醚分析纯（AR）广州化学试剂厂乙酸乙酯分析纯（AR）广州化学试剂厂乙腈分析纯（AR）广州化学试剂厂四氢呋喃分析纯（AR）广州化学试剂厂乙酸分析纯（AR）广州化学试剂厂2,3-二氯-5,6-二氰-1,4-苯醌分析纯（AR）安徽泽升科技有限公司表SEQ表\*ARABIC2实验仪器仪器名称出产公司HitachiF-700型荧光光谱日本Hitachi公司Bruker-400型核磁共振波谱仪德国Bruker公司BrukeresquireHCT型质谱仪德国Bruker公司AgilentGeminiAUltra型单晶衍射仪美国Agilent公司ZF-90型多功能紫外暗箱透射仪上海安瑞自动化仪器仪表有限公司81-2型恒温磁力搅拌器上海斯勒仪器有限公司SHZ-Ш型循环水式真空水泵巩义市峪华仪器厂RE-52AA型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂AR1230型电子天平上海菁海仪器有限公司2.3目标产物的合成及表征4-叔丁基-2,6-二甲酰基苯酚(453mg，2.2mmol)和邻氨基苯酚(218mg，2mmol)的乙醇溶液在N2气氛下搅拌回流一小时后，溶液变成棕色，之后加水析出红色固体，红色固体发橙红色荧光，之后抽滤出红色固体，也就是中间产物HME。再将中间产物HME和氨基硫脲的乙醇溶液放入试管反应器中，搅拌回流4小时，接下来，我们经过抽滤处理，获得了最终的粗产物HMEI。为了提高其纯度，我们使用乙酸乙酯和石油醚(1:10)混合后进行硅胶柱层析纯化。经过该纯化方法，我们成功地获得了68%的HMEI产物。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ11.93(s,1H),9.19(s,1H),8.38(s,1H),8.12(d,J=2.5Hz,1H),7.98(d,J=2.5Hz,1H),7.78–7.72(m,1H),7.68–7.62(m,1H),7.45–7.38(m,2H),6.37(s,1H),1.40(s,9H).13CNMR(600MHz,CDCl3)δ162.55(s),155.85(s),149.17(s),142.61(s),139.79(d,J=4.2Hz),126.75(s),126.59(s),125.82(s),125.33(s),120.51(s),119.44(s),111.04(s),110.84(s),34.51(s),31.42(d,J=15.7Hz)3实验结果与讨论3.1探针HMEI结构分析我们使用核磁共振质谱仪对该HMEI产物的结构进行了检测。如附录图15所示，是产物HMEI的氢谱，本图谱呈现三种特征峰，即多重峰位于1.40ppm处，单重峰分别位于6.37ppm及7.62-11.93ppm之间，以及双重峰位于7.38-7.45ppm间，总共包含19个氢。羟基上的氢未显现于图中，但数据解析可证实两个苯环及碳链部分带有氢峰。根据上述峰位氢数计算，产物HMEI所含20个氢符合实验结果，进一步验证了其结构正确性。据附录图16所呈现碳谱结果，产物HMEI中碳元素数与该HMEI分子式所示数值相同，这进一步加强了该产物HMEI相关性的准确性。为了深入探究产物HMEI的准确性，本文在其上进行了质谱分析（见图17），结果表明，经离子峰分析计算后，该HMEI相对分子质量为366.1235，与理论值基本吻合，从而进一步印证了该产物的可靠性。3.2荧光性能研究由图10可知最终产物HMEI母液与次氯酸钠的不同体积比(0、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60)存在下的荧光变化；根据前人的研究，我们已知高选择性是探针应用的前提。当最终产物HMEI母液与次氯酸钠的不同体积比不断减小时，最终产物HMEI的荧光逐渐增强，在最终产物HMEI母液与次氯酸钠的体积比为1:55时，此时出现了一个明显峰，荧光强度也较强。图10探针HMEI与次氯酸钠的不同体积比的荧光强度变化在确定探针HMEI母液与次氯酸钠的体积比为1:55的条件下，经过实验评价,探针表现出了良好的响应次氯酸的能力。接着,本文对探针HMEI与次氯酸钠体积比为1:55情况下的响应速率进行了深入探讨（详见图11）。结合所绘制的图表数据,可以明显观察到,当反应时间在0-250秒内,探针HMEI的荧光信号逐步扩大,到达250秒后,荧光信号显著增强并达到响应平台。总的来看,这些结果表明探针HMEI与次氯酸之间的反应速度较快,响应时间短,因此具有成为检测液体中次氯酸快速工具的潜力。图11该探针HMEI和次氯酸钠体积比为1:55的响应速度3.3探针HMEI对次氯酸的离子响应分析3.3.1探针HMEI对不同离子的荧光强度分析本次实验我只研究了HMEI的光学性能。研究了HMEI在THF溶液中的光谱性质。图12显示了不同HMEI的浓度与荧光强度的关系，且在不同干扰离子条件下，游离的HMEI显示出峰的高度是不同的，在加入OCl-后，游离的HMEI在545nm左右处有一个明显的吸收峰；而其他大部分离子加入后，如Cu2+、Co2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+、F-、I-、NO2-、SO42-和H2O2、OH-，则是在545nm处显示出了一个较高的吸收峰。由图可知，545nm处的吸收峰相对于445nm左右处的吸收峰的高度较低，因此，与其他干扰离子相比，OCl−的加入能显著增强荧光（图12）。且此竞争实验也进一步证实了HMEI对CIO-的高选择性。且也证实了HMEI在生物样品和复杂水样中具有检测次氯酸的潜力。图12探针HMEI对不同离子响应的荧光光谱图3.3.2探针HMEI对次氯酸的荧光颜色现象分析由图13知，在不同离子OCl-、Cu2+、Co2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+、F-、I-、NO2-、SO42-和H2O2、OH-的干扰下，最终产物HMEI所显示出的荧光强度是不同的，在加入OCl−后，吸收强度显著增加，溶液颜色也显著增强，游离的HMEI在大约445nm处发出强烈的荧光，荧光呈现出深蓝色的荧光。加入Cu2+、Co2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+荧光颜色不明显，加入F-、I-、NO2-、SO42-虽也显现出了较亮的黄色荧光，但是相对于OCl-的加入，其荧光强度较弱。因此，由图可知，次氯酸离子的响应强度是最好的。且也证实了探针HMEI对次氯酸OCl-具有较高的选择性。图13探针HMEI对不同离子显现的荧光颜色3.3.3探针HMEI对次氯酸的选择性分析因检测样品的表征和实验技术所导致的各种不确定因素的存在，因此，目标检测物品的指定性能是否能得到探针的精确响应，这种判断目前被视为评定探针性能优劣的重要参考标准之一。由图14可知，我们进一步对OCl-、Cu2+、Co2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+、F-、I-、NO2-、SO42-和H2O2、OH-等各种干扰进行了选择性实验及分析。研究结果表明，化合物HMEI的F449/F543在OCl-中最高，可以得出探针HMEI在次氯酸盐溶液的荧光强度明显增强，而其他各类离子干扰物则未能对荧光产生相关的显著变化，说明此探针具有高度的次氯酸盐选择性，被证明可以有效地应用于复杂环境下的次氯酸盐检测，以及对水体和生物样品中次氯酸盐的重要性能检测。图14探针HMEI对不同离子的选择性4结论综上所述，在本论文中，本研究针对4-叔丁基-2,6-二甲酰基苯酚分子结构进行了合理的设计和改造，最终成功合成了一种新型的次氯酸荧光分子探针，即HMEI探针。运用多种手段对其进行了分子结构表征，并探究了其响应次氯酸的反应机制。进一步，本文利用光谱性能测试仪器评估了HMEI探针的次氯酸检测能力，包括对响应速度、检测灵敏度和特异性等方面进行了全面研究。最终我们可得出以下结论，探针HMEI对次氯酸盐具有高度的选择性，可用于检测复杂环境中的次氯酸，也能在检测水体和生物样品的次氯酸中发挥重要性能。因此，该探针HMEI有望成为检测次氯酸的新型工具。

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