DB51T 1523-2012 桑蚕白僵病诊断技术规程　　

DB51DB51/T1523—2012桑蚕白僵病诊断技术规程2012-12-20发布2013-03-01实施四川省质量技术监督局发布I 1 14试剂 1 1 38附录A 4Ⅱ本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局发布。本标准起草单位：四川省蚕业管理总站、四川省农业科学院生物技术与核技术研究所、乐山市蚕种质量检疫检验站、内江市蚕种质量监督检验站。本标准主要起草人：吴钢、蔡平钟、张学清、马露芸、颜建平、何东。11范围2规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义4试剂4.1酒精[w(CH₃CH₂OH)=70%]。4.2分析用水按GB/T6682规定执行。4.3马铃薯蔗糖琼脂培养基(见附录A)。5.2载玻片、盖玻片、培养皿、吸管、玻璃棒、分装漏斗，量筒、烧杯、锥形瓶(500mL、250mL)、试管(10mm×75mm),样品袋、冻存管(1.8mL、5mL),解剖剪、镊子、接种针/环、牛皮纸、不锈钢锅(1000mL～2000mL)、电炉(500w~1000w)、药勺、纱布、棉塞。6观察6.1外观观察26.1.1幼虫症状期发病，多呈半脱皮或不脱皮蚕；濒死时排软粪，吐胃液，体液略呈乳白色弛，略有弹性，后逐渐变硬；死后1d~2d,尸体的气门、口器及节间膜处长出菌丝及白色粉末，逐渐6.1.2蛹、蛾症状出菌丝及白色粉末；蛾期发病，不能产卵，死后尸体干瘪，翅、足易折断。6.2显微镜观察6.2.1样品采集采集6.1描述的典型个体症状病蚕，置于样品袋或冻存管中，做好记载。6.2.2样品处置6.2.2.1样品保存样品随机分成2份，一份作为检样供检验；另一份作为备样，保存于0℃~4℃冰箱中，保存期6.2.2.2样品制备6.2.2.2.1取濒死病蚕，经酒精[w(CH₃CH₂OH)=70%]进行蚕体消毒，用解剖剪剪去尾角，滴1滴～2滴血液，涂抹于载玻片上(过干或过浓时，可滴加1滴～3滴无菌水),盖上盖玻片，制成镜检样本。6.2.2.2.2用镊子夹取病死蚕尸体覆盖的白色粉末，置于载玻片上，滴入1滴～3滴无菌水，捣烂，盖6.2.3镜检观察将镜检样本分别置于显微镜(15×40倍或16×40倍)下观察，每个样本观察不少于20个视野。6.3接种观察按6.2.2.2.1方法取3头~6头出现相同症状病蚕血液各1滴～3滴，或按6.2.2.2.2的方法取3头~6头病蚕(蛹)身上的白色粉末各少许，分别置于无菌试管中，各加1滴~3滴无菌水，用无菌玻6.3.2分离培养将6.3.1制备的血液或白色粉末样品，用接种环(针)划线接种于马铃薯蔗糖琼脂无菌培养基上，在28℃±1℃的恒温培养箱中培养2d~5d。6.3.3接种取6.3.2培养基上出现的白色粉末5接种环～10接种环于无菌试管中，加5mL～10mL无菌水，3用无菌玻璃棒搅拌均匀，浸无菌桑叶或拌合无菌人工饲料喂食2龄~3龄桑蚕，常规饲育5d~10d。通过外观观察，桑蚕出现6.1表述症状时，可初步诊断为白僵病。7.2显微镜观察判定7.2.1按照6.2.3镜检观察6.2.2.2.1样本，发现有圆筒形或长卵圆形芽生孢子时，样品可确诊为桑蚕白7.3接种观察判定当按照6.3接种后的桑蚕出现6.1.1描述症状，且按6.2.2.2.1、6.2.2.2.2制备镜检样本，镜检观察分别与7.2.1、7.2.2一致时，样品可确诊为桑蚕白僵病。4(资料性附录)A.1成分及比例A.2制备方法A.2.1将盛有1000mL水的不锈钢锅置于电炉上加热。A.2.2称洗净去皮新鲜马铃薯200g,切成约1cm³的小块，放入加热的不锈钢锅中，煮沸10min~20A.2.3用纱布过滤，滤液倒回不锈钢锅中，加入少量热水至1000mL,再置于电炉上加热至沸腾。A.2.4加入称好的蔗糖20g、琼脂15g,不断搅拌至琼脂完全溶化，停止加热。A.2.5补充热水至1000mL,充分搅匀，用分装漏斗将其分装至试管(每管约4mL)或培养皿(2mm~