第八章-食品微生物检验的质量控制

第九章食品微生物检验的质量控制GB4789.1-2010食品微生物学检验总则GB4789.28-2013培养基和试剂的质量要求GB/T27405-2008实验室质量控制规范

食品微生物检验内容食品微生物检验质量控制概述食品微生物检验的室内质量控制食品微生物检验的室间质量控制食品微生物检验质量控制概述一、质量控制相关定义质量控制：满足质量要求的操作技术和活动。质量保证：为了满足实验室质量要求，制定相应的计划并实施所进行的一系列系统活动质量手册：是描述质量系统元素的文件或文件的集合。二、食品微生物检验质量控制概念质量控制是食品微生物学实验室为了保证检验结果实事求是地反映客观存在而建立的操作程序体系。三、食品微生物检验质量控制目的食品微生物学的质量控制是保证食源性致病菌的培养、分离、鉴定及血清学试验等的准确性，避免因操作变化导致检验结果错误。四、质量控制分类分为室内质量控制和室间质量评价两个组成部分室内质量控制：实验室内部采取的以对比分析、跟踪以及对实验室工作的连续性控制计划。室间质量评价：通过互相校准和/或检验对实验室的操作和结果所进行的评价。五、质量控制内容室内质量控制

实验室内部

质量保证的核心和基础室间质量评价

外部组织或机构

质量评价食品微生物学检验

室内质量控制室内质量控制一、对检验人员的要求二、操作手册三、检测环境要求四、设备/仪器要求五、仪器设备的功能监测六、培养基的质量控制七、试剂、染色液及抗血清的质控八、检验过程的质量控制九、标准菌株的来源和保存十、实验室安全防护一、对检验人员的要求相应岗位的人员，应具备相应的技术能力，相应的技术能力证明（证书及证件）。微生物检验室应有相应技术能力的人负责室内的技术工作，并设立质量监督员。一、对检验人员的要求高度的主观判断力

个人的技能、经验细菌学的专业水平培训班实验室进修学术交流专业期刊二、操作手册各级人员的职责和权限实验室安全措施样品采集和处理指南培养基和试剂的配制方法….等等三、检测环境要求-房屋要求房屋要求：足够宽敞、通风、有良好的照明。房屋内墙面及地等应采用易于清洁的材料。房间的设置应根据工作内容加以分用，设立专用房间。三、检测环境要求-环境设施要求专用房间的温湿度控制与记录（样品存放室）特殊环境的微生物指标控制与记录（无菌室等）专用工作室的标准操作规程和定期的检测校准程序。（洁净室等）特殊环境中的专用设施质量控制应符合有关要求（净化工作台）三、检测环境要求食品微生物学检验室要求布局合理，操作区域与办公区域分开。洗涤室、培养室、消毒间、无菌室应分开。无菌室要设有套间或缓冲间。微生物检验室应备有自动或脚踩式洗手池和固定的消毒设施。微生物实验室要求细菌49.1%，病毒31.6%，立克次氏体11.3%，真菌5.7%，寄生虫2.3%。要做到检验结果准确，又不造成自身感染和从实验室扩散病原微生物，对实验室必须有具体的要求。基本要求：合理的实验室建筑结构和布局、设备设施、规章制度、人员能力等。生物危害评估生物因子的种类（已知、未知和基因修饰的）来源传染性致病性传播途径在环境中的稳定性感染剂量、浓度动物实验数据预防和治疗情况微生物危害程度的分级Ⅰ级（低个体、群体危害）：不会导致健康人和动物致病的微生物。Ⅱ级（中等个体危害，有限群体危害）：能导致发病，但一般情况下对健康个体、群体和环境不会引起严重危害的病原体。有治疗药物且传播风险有限。Ⅲ级（高个体危害，低群体危害）：能引起人或动物严重疾病，或造成严重经济损失；但不会因偶然接触而传播，或有治疗药物的病原体。Ⅳ级（高个体危害，高群体危害）：能引起非常严重的、一般不可治愈疾病，容易在直接、间接或偶然接触中传播的病原菌。安全控制生物安全防护级别与其拟从事的实验活动相适应。一级、二级实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动。三级、四级实验室认证后可从事高致病性病原微生物实验活动。对我国尚未发现或者已经宣布消灭的病原微生物，任何单位和个人未经批准不得从事相关实验活动。食品微生物检验室设计原则：方便、使用、保证检验工作的顺利进行组成：准备室、洗涤室、灭菌室、无菌室、培养室和普通实验室安全级别：为了防止交叉污染，保护工作人员健康，实验室应至少划分成3个区：清洁区、操作区和。清洁区范围：包括办公室、休息室、培养基配制室与试剂储藏室。基本要求：此区域禁止带人细菌检验标本。

操作区（1）范围：药品、血清、菌种、样品、试剂、培养基制备与准备。（1）整洁：微生物操作区是各种病原菌相对集中的地方，为了减少粉尘流动，防止交叉污染，操作区应与外界分开。工作前后，进行消毒。（2）光线：除设置常规照明灯外，还必须安装操作台灯，以保证实验结果的正确判断。

（3）

通风：由于各种病原菌集中，空气污浊，实验室要求保持排的生物安全柜中进行。

操作区（2）（4）温度和湿度：不能安装吊扇，应安装空调。（5）电源：要求提供稳压、恒频的电源；根据仪器设备要求，必要时配备不间断电源。（6）水源：操作区内须设置水源。用于标本处理（如细菌染色）

的水槽与工作人员洗手用的水槽不能混用。（7）污染物处理：操作区须备有消毒缸，以处理沾有活菌的玻片等污染物品。检验剩余的标本及使用过的带菌平板、试管均须集中地点安全放置，经消毒灭菌处理后再洗涤或丢弃。无菌区（1）无菌室应完全封闭，进出无菌室至少要经两道门，中间隔有缓冲间，无菌室与外间设置一个可开闭的窗口，用于传递器具。（2）无菌室必须保持整洁。工作人员进入无菌室应换专用鞋、专用衣。无菌室使用前须用紫外线消毒30min

，操作结束后清洁台面，再用紫外线消毒30min

。定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。（3）无菌室仅用于培养基分装等无菌操作，不能进行有菌标本的操作。操作人员操作时应严格关门，并戴好专用的口罩、帽子。室内的布局(1)动仪器与静仪器分开：精密仪器（如光度计、天平、比色计、酸度计、色谱仪等）应必须与震动仪器（如震荡器、验粉筛、离心机、搅拌器等）。(2)常温与热源设备分开：热源仪器（如电热蒸馏水器、恒温干燥箱、高温电阻炉、恒温培养箱、水浴锅、电炉等）必须与其它一切设备分开，不然会影响其它设备的正常使用，严重的会造成热蒸汽腐蚀其它设备，影响其使用寿命。(3)化学分析台与热源设备分开：化学分析台面上应尽量少放易燃和腐蚀性试剂。使用电炉或酒精灯加热时应坚持有人看管和监视。化学分析台的摆放应远离热源设备。检验室建设布局图

1.办公台2.文件柜3.样品柜4.通风橱5.实验边台6，7.无菌台8.天平台9.在落地仪器区再加个高温仪器台，放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等无菌室建设

无菌台上可放置的物品物品数量物品数量酒精灯1个灭菌营养琼脂200ml打火机1个灭菌双料发酵管6根接种针1个灭菌单料发酵管12根消毒面团1瓶灭菌平皿10块洗耳球1个试管架2副镊子1个2ml灭菌吸管5根油笔1支10ml灭菌吸管3根试管篓2个125ml灭菌烧杯2个三、检测环境要求微生物检验室应制定合理、完善的卫生管理制度，采用湿式保洁，定期对操作环境进行消毒。对废弃物，应投入指定的容器内，经无害化处理后方可排放，，以防某些病原微生物传播。需在无菌条件下工作的区域应以明确标识并能有效地控制、监测和记录。每天记录环境检测报告，并经常进行空气落菌实验：定期对无菌室进行室内环境消毒。三、环境设施的相关技术指标净化室、净化工作区域、洁净环境按国家及部颁标准进行检测。空气洁净度指标：检测频率及检测方法。一次/月；空气细菌检测（沉降法）。级别≥0.5μm尘粒(个/L)≥5μm尘粒(个/L)活菌颗粒平均数(cfu/平板)100≤3.5≤0.0≤1.010000≤350.0≤2.5≤3.0四、设备/仪器要求-总则满足开展相关检测项目的要求。制定相关设备/仪器的作业指导书。设备/仪器需进行检定校准。设备/仪器的运行状况记录。维修后设备/仪器的再校准或检查，应具有完整的检查记录。温度计实验室必须要有工作温度计和参照温度计。工作温度计：用于日常温度检查。参照温度计：用于校正工作的温度计。温度计运行检查：一般可采用一次/半年的运行检查。日常检查、校准检查、运行检查等都应做好相应的记录。培养箱、水浴箱和冰箱的温度控制培养箱的温差要求，一般显示值与实测值相差不大于±1℃，箱体内各点温差（内部的温度均衡性）以及温度波动同样不大于±1℃。温度监控方法：可将工作温度计置甘油中，放入待测箱体内，观察工作温度计的温度，最好1-2次/天监控并记录。高压灭菌锅的温度控制（一）高压灭菌锅；可用生物指示菌法（常用）、化学变色纸片及高压灭菌锅温度计等方法进行检测。生物指示菌法是一种高压灭菌锅的效果显示法。高压灭菌锅由专人操作，并做好作业记录。高压灭菌锅使用时，内置物品不能太多，单位体积内的内容物（每瓶内的培养基）不能太多。高压灭菌锅的温度控制（二）高压灭菌锅温度波动范围：110，115和121±2℃。高压灭菌锅校准周期一般在半年。干燥灭菌箱温度控制干燥灭菌箱的温度校准：用参考温度计进行温度测试。干燥灭菌箱温度要求与精确度：160±5℃或180±5℃。干燥灭菌箱校准周期一般为一年。培养基配制用蒸馏水的控制按设备说明，定期清洁离子交换器和更换离子交换材料。检测要求：西欧标准为微生物检验用蒸馏水的特定电导率＜0.5ms/m；细菌数＜50cfu/ml。我们日常用的标准为＜10ms/m。检测频率：1次/每月。蒸馏水定点供应，并做好相应的质量控制及记录。天平的管理天平放置要求：无振动、无气流影响及水平台面上。天平要有使用记录。天平作为计量仪器是列入国家强制检定的范围，一般1次/年进行检定。容积的控制（一）保证高压灭菌后的稀释剂满足标准用量。采取称中法来测定蒸发量，体积100ml的稀释剂起重量为101g。高压结束体积偏差不得超过1%。采取先高压后定量分装，可避免因高压造成的体积误差。对保存的定量液体应在使用时，注意补充容积。容积的控制（二）吸管的控制：通过小计量容器校准后使用。小计量容器吸管、容量瓶、量筒等玻璃器皿，校准周期一般为1-2次/一年。小计量容器日常使用检查可每周进行一次，包括容器的完整性，并做好相应的记录。pH计pH计使用前应用标准液进行校准。缓冲液使用有效期：PH4.00约1年

PH7.00约6个月

pH9.00约6个月pH计的维护：电极外表的定期清洗；电极敏感性检测及极性恢复。净化工作台的控制水平流净化工作台工作区域，要求洁净度为100级。空气沉降30min，细菌数＜1个/皿。垂直流净化工作台，细菌数＜0.49个/皿.净化工作台运行检查频次：1次/月，采用细菌沉降检测。净化工作台高效过滤膜一般为一年更换一次，并同时进行粒子与细菌沉降检测。紫外线灯的控制检测方法：仪器测试法和生物测试法。前者是通过专用仪器检测紫外灯管发射的紫外光强度。国家消毒技术规范中表明在距离照射源1米处，要求其强度为90lx。生物测试法：采用一定的菌培养物，经一定比例稀释，菌量控制在200-250个/0.5ml，涂布平板在紫外灯光下照射2min，同时设置普通光源的对照组，置37℃培养48h，计算其杀灭率，要求杀灭率达99%。显微镜的控制显微镜应有作业指导书，日常维护记录及自校记录。显微镜应置于无振动、避免灰尘、防潮等要求的环境。其它微生物检测专用仪器的控制细菌鉴定仪、酶标仪等设备，工作中常用阳性对照检测其功能的正常性。仪器的检定则按检定或自校作业指导书进行。仪器的使用登记、校准计划、校准记录等文件存档。仪器专人使用，操作者应持证上岗。五、仪器设备的功能监测高压灭菌器：定期监测（每月一次）

生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌化学指示剂：变色的指示带培养箱、冰箱、水浴箱：

每日早、晚两次温度观测，绘制温度曲线图五、仪器设备的功能监测厌氧培养装置：

化学标记：美蓝生物学指标：铜绿假单胞菌CO2培养箱：

每天检查箱内的CO2含量五、仪器设备的功能监测生物安全柜：

定期更换滤网，紫外线每3月检查1次微生物鉴定仪及时更新软件每批号鉴定卡用标准菌株测定五、仪器设备的功能监测

表1仪器设备的质量控制标准设备

控制标准

允许范围高压灭菌器121℃

≥121℃培养箱

35℃

±1℃水浴箱

37℃

±0.5℃冰箱

4℃

±2℃低温冰箱-20℃

±5℃CO2培养箱5%~10%

<10%培养基的有效性试验每一批新制或新购的培养基，使用前均须取标准菌株试验.培养基的试验结果需要加以记录，项目包括试验日期、试验结果以及实验者的签名等。六、培养基质量控制培养基质量控制培养基的量：平板培养基的厚度一般为3mm

(90mm平皿+15-20ml培养基）斜面不超过试管的2/3常用培养基的质量控制（一）检验项目与方法：物理、化学及生物学指标鉴定A：感官测定，检查其颜色与透明度，培养基应澄清，无浑浊。B：PH测定，按各种培养基要求的PH±0.2。C：生物学指标检定，无菌实验、被检培养基相应细菌生长率测试；菌落大小及特征的检测。常用培养基的质量控制（一）无菌试验：

每批配好的培养基须进行无菌试验随机选取5%-10%的量，如果配制大量的培养基，则任意选取10个平板或管装培养基，35℃温度下过夜培养，证明无菌生长为合格常用培养基的质量控制（二）生长率测试：适用于液体和固体培养基：将菌培养液，用生理盐水做倍比稀释，取合适稀释度进行平板计数，同时以新鲜配制的国标培养基进行对照。菌落大小测试：划线分离测试菌，取10个菌落测量直径大小，其直径均值与新鲜配制的国标培养基无统计学差异。常用培养基检定用标准菌株表2常用培养基的质量控制培养基质控菌种生长情况结果血琼脂

巧克力琼脂营养琼脂麦康凯琼脂

中国蓝琼脂

SS琼脂

沙保罗琼脂

化脓链球菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌福氏志贺菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌福氏志贺菌金黄色葡萄球菌产气肠杆菌鼠伤寒沙门菌大肠埃希菌白色假丝酵母菌++++++-++-++-+明显乙型溶血环甲型溶血环24h生长生长分解乳糖，菌落红色不分解乳糖，菌落无色透明不生长分解乳糖，菌落蓝色不分解乳糖，菌落无色不生长粉红色菌落无色菌落，中心黑色

常用培养基检定用标准菌株表2常用培养基的质量控制生长生长，溶血生长部分抑制生长，黄色菌落生长，蓝绿色菌落大量生长抑制生长++++++-脆弱拟杆菌产气荚膜梭菌菌空肠弯曲菌大肠埃希菌霍乱弧菌副溶血弧菌霍乱弧菌大肠埃希菌厌氧血平板

弯曲菌琼脂TCBS琼脂碱性蛋白胨水

结果生长情况质控菌种培养基

培养基保存环境

制成的培养基保存环境为4℃冰箱，如制成平板则用塑料袋包装置冰箱保存，干燥培养基干粉含有活性物质或遇热易分解的物质应仔细查看存放条件，多数也须放在2-8℃条件保存。含有高浓度胆盐的培养基存放于10-15℃。培养基配制的质量控制培养基的制作过程必须统一培养基或添加剂的剂量、pH值、高温灭菌的时间或温度，都需遵照规定培养基名称、本批配制量、配方、配制日期和配制人员姓名都必须详细记录

培养基制备控制程序

培养基配制所用的仪器设备必须经过相应的鉴定。配制培养基所用的用具及容器必须是清洁或是灭菌的。培养基的配制程序不同的培养基配制时注意各类成分的用途。对于干燥培养基配制，同样需要进行PH测验。配制好的培养基（尤其是糖发酵管）不宜久放。因为培养基吸收空气中的二氧化碳，会使培养基变酸，从而影响细菌的生长。培养基中的抑制剂及指示剂一定要精确称量。七、试剂、染色液及抗血清的质控染色液的质量控制

染色液要标明配制或购入日期，选用适当的标准菌株作阳性及阴性对照鉴定。革兰氏染色用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌制备浓菌悬液进行质量控制，每次质控与标本检测同步进行。七、试剂、染色液及抗血清的质控各种染色液的监控菌株染色液阳性对照菌阴性对照菌监控频度革兰染色液金黄色葡萄球菌大肠埃希菌每天抗酸染色液结核分枝杆菌每次异染颗粒染色液白喉棒状杆菌每次荚膜染色液肺炎克雷伯菌每批鞭毛染色液普通变形杆菌福氏志贺菌每次七、试剂、染色液及抗血清的质控试剂的质量控制各类试剂，在配制或购入后均应进行“有效”试验，用已知阳性及阴性菌株进行试验试剂须根据标示配制，适当储存对较稳定的试剂如靛基质试剂应在配制时及每周予以检测，凡不稳定的试剂每天使用时均应检测，合格后才能使用七、试剂、染色液及抗血清的质控表3常用试剂的阳性、阴性对照菌株常用试剂阳性对照菌株阴性对照菌株凝固酶试剂金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌触酶试验用试剂化脓链球菌V-P试验用试剂阴沟肠杆菌大肠埃希菌大肠埃希菌阴沟肠杆菌氧化酶试剂铜绿假单胞菌大肠埃希菌

靛基质试剂金黄色葡萄球菌七、试剂、染色液及抗血清的质控诊断血清的质量控制购入的沙门菌属、志贺菌属、致病性大肠杆菌的诊断血清必须立即记录其购入日期、观察透明度、色彩有无变化和是否有沉淀物，然后置4℃冰箱保存使用前应注意检查诊断血清的批号、有效期，如发现浑浊或有絮状沉淀物时，很可能系污染所致，不能再继续使用七、试剂、染色液及抗血清的质控诊断血清的质量控制使用前应以阳性及阴性菌株进行检测，观察其效价及特异性不得将诊断血清置室温保存,各种诊断血清均应置冰箱中4℃保存每月用标准菌株进行一次测定

八、检验过程的质量控制

检测质量保证定期使用有证标准物质和次级标准物质（参考物质）进行内部质量控制。参加实验室间的比对或能力验证利用相同或不同方法进行重复检测对留存的样品进行再检测。重复计数要求菌落计数精密度控制直接计数，选择同一标本，要求检验人员进行菌落计数。自身同一平皿重复计数误差应小于7.7%实验人员之间同一平皿重复计数误差±18.2%自身同一梯度平行加样两皿间相对误差小于7.7%实验人员之间同一梯度计数误差±18.2%不同梯度间菌落计数最终误差小于7.7%菌种鉴定质控菌种鉴定质控要求，对所给的微生物菌种，按有关的方法及指标进行生化、血清等方面的鉴定。鉴定质量评价：鉴定程序是否正确；鉴定方法是否正确；具体操作技术是否熟练，结果报告是否正确。内部质量控制的推荐频率菌落计数精密度控制：1次/3月；菌种鉴定控制：1次/半年或1年九、标准菌株的来源和保存标准菌株要求必须是形态、染色反应、生理生化及血清学特性典型而稳定的菌株实验结果重复性好，极少发生变异国际社会认可来源于专门机构九、标准菌株的来源和保存标准菌株来源美国典型菌种保藏中心ATCC卫生部药品生物制品检定所菌种保藏中心国家医学微生物菌种保藏中心九、标准菌株的来源和保存标准菌株的保存方法

冷冻干燥法：最理想的保存方法，不改变菌种性状，保存时间长手续繁琐，需专门的冷冻干燥设备菌种保存中心均采用此法九、标准菌株的来源和保存标准菌株的保存方法冰冻保存法：此法较简单，将细菌混悬于脱纤维羊血或脱脂牛奶中，置液氮或-20℃冰箱保存但细菌经多次转种，性状可能发生变异九、标准菌株的来源和保存标准菌株的保存方法培养基保存法：最简易方便的方法，适用于大多数实验室（1）普通琼脂斜面保存法：适于一般细菌的保存，置4℃冰箱可保存1个月。（2）血琼脂斜面保存法：适于链球菌，可半月转种一次。（3）半固体穿刺法：穿刺培养基并加液体石蜡，置4℃冰箱可保存3-6个月，适用于肠杆菌科细菌。九、标准菌株的来源和保存食品微生物检验实验室必备质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922大肠埃希菌ATCC35218铜绿假单胞菌ATCC27853金黄色葡萄球菌ATCC25923粪肠球菌ATCC29212十、实验室安全防护培训与告之警示标志防止空气污染有毒有害物防护消除污染和废物的处理食品微生物学检验

室间质量评价室间质量评价室间质量评价是质量保证体系的重要组成部分。实验室应参加外部的质量控制活动，对其开展的每一项检测均应参加相应的室间质量控制。质量控制中的比对实验室应定期对实验用菌株、培养基、试剂等设置阳性对照、阴性对照和空白对照。实验室应对重要的检验设备（特别是自动化检验仪器）设置仪器比对。实验室应定期对实验人员进行技术考核和人员比对。室间质量评价室间质量控制的一般性检查项目1、仪器设备的操作书，使用、保养、维修记录。2、培养基和试剂的配制记录、培养基的保存方法、灭菌质

量、有效期。3、室内全面质量控制的建立，工作人员熟练程度的考核和盲样试验的进行情况，检验操作手册及操作规范性室间质量评价熟练程度的考核用模拟食品标本做质量评价是目前国内外广泛采用的方法，主要评价实验室在病原菌的分离、鉴定试验等方面的工作情况。室间质量评价熟练程度的考核由质控管理机构发放模拟标本或菌种，实验室按照日常的操作方法进行相应的分离鉴定试验。实验室完成鉴定后在规定时间内将结果反馈至参考实验室，进行评价。微生物检验的质量控制

——技术质量考核方法基本操作及理论知识菌数测定技术（涂布法，枯草杆菌）生化试验重现性（铜绿假单胞菌）模拟样品检出考核（在合格的基质中加入定量指示菌）仪器的正确使用室间质量评价质控结果的分析与评价质控管理机构对每次质控结果进行统计分析，将每一实验室的结果与标准进行比较和统计分析，发回评估报告。