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辣椒品种纯度鉴定SSR分子标记法2015-01-23发布2015-03-23实施I前言 Ⅱ 3.1主要仪器设备 3.2主要试剂 3.3主要耗材 2 24.4银染、显影试剂 24.5显影液 36操作步骤 36.1供试品种样品制备 3 36.3PCR反应体系和程序 36.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 6.5染色和显色 4 附录A(资料性附录)部分SSR引物信息 本标准按照GB/G1.1—2009给出的规则起草。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省农业标准化技术委员会提出并归口。本标准主要起草单位：湖南省蔬菜研究所。本标准主要起草人：郑井元、刘峰、邹学校、张竹青、马艳青、戴雄泽、李雪峰。1本标准适用于采用SSR分子标记法进行辣椒品种纯度鉴定。2原理简单重复序列(Simplesequencerepeats:S研钵、液氮罐、电子天平、恒温水浴锅、高速台式离心机(14000r/min)、紫外分光光度计、高数码相机、胶片观察灯、冰箱(4℃和-20℃)。3.2主要试剂4试剂配制4.1DNA提取试剂4.1.10.5mol/LEDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)(pH8.0)溶液称EDTA186.1g,加入已有800mL双蒸水的烧杯中，用氢氧化钠调节pH值至8.0,补双蒸水2称121.1gTris加入含有800mL双蒸水的烧杯中，用盐酸调节pH值至8.0,补双蒸水定容取160mL三氯甲烷，8mL异戊醇和32mL无水乙醇加在一起混匀，4℃冰箱保存备用。称取溴酚蓝0.25g,二甲苯青0.25g,加98mL甲酰胺溶液和2mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶3后10,000rpm离心5min;将上清仔细移至另一2mL离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温静500μL60℃预热的双蒸水，再加入5μLRNaseA(10μg/μL),37℃温浴10min,最后加入1/10序：94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,35个循环后72℃延伸5min,扩增完后4℃保46.4.3封胶6.4.5灌胶每个PCR产物中加5μL6×加样缓冲液，混匀，每个加样孔加入(3~4)μL样品。180V恒温电6.5.1固定6.5.2染色倒掉蒸馏水，加入200mL染色液，在30r/min的水平摇床中，摇10min,倒出染色液，用蒸馏水漂洗2次。6.5.3显色加400mL显影液，轻轻摇动，待条带清晰后，倒掉显影液，迅速加入固定液定影5min,用蒸馏子纯度(Pure:P)的数值以%表示，按公式(1)计算：5公式中：

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