微生物系列专题03人体微生态研究常见思路及案例详解

®人体微生态常见研究思路及案例详解解螺旋

|

知识金牌解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌01常见研究思路及案例详解02人体微生态整体研究路线CONTENTS课

程

目

录人体微生态整体研究路线01解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌表型干预时间群体选择粪便肠黏膜……样本选取16S宏基因组宏转录组代谢组……检测物种数据 •基因分析 •功能代谢临床指标多组学动物实验验证结果验证人体微生态研究整体路线解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌人体微生态研究方法DOI:10.3389/fped.2017.00138代谢产物基因表达水平群落组成基因及基因功能宏基因组学宏转录组学宏蛋白组学宏代谢组学DNARNA蛋白质代谢产物蛋白水平微生物多样性宏基因组测序宏转录组测序蛋白质检测代谢产物检测人体特定部位研究对象组学技术研究方法产出解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌DOI:

10.1021/acsnano.5b07826不同组学技术能够得到的信息解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌微生物实验设计需要考虑的因素Doi:10.1038/s41579-018-0029-9解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌重复性选择性一致性关联性多个体，多位点，大样本量，以排除个体之间的差异遗传背景、生活饮食习惯、生长

环境、性别年龄、取样方法、提取方法一致排除有严重病史、使用抗生素、有药物依赖等个体采集与研究疾病相关的生理生化指标，研究致病性原因取样策略总结入选标准：有糖尿病的汉族人（年龄：>50岁；6.5%

≤

糖化血红蛋白HbA1c

≤

12.0%

。）；排除标准：I

型糖尿病；严重的糖尿病并发症（糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变、糖尿病肾病和糖尿病足）；严重肝病(包括慢性持续性肝炎、肝硬化或乙肝病毒表面抗原阳性或肝转氨酶异常(血清丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶>2.5×上限)；报名前3个月内连续使用抗生素>3天，连续使用减肥药>1个月，8周内服用过益生菌；胃肠手术(阑尾炎或疝手术除外)；在招募前6个月内患有严重精神疾病；接受药物治疗以治疗胆囊炎、消化性溃疡、

尿路感染、急性肾盂肾炎、尿囊炎或甲状腺机能亢进；垂体功能障碍；严重器质性疾病，包括癌症、冠心病、心肌梗死或脑卒中；传染病，包括肺结核和艾滋病；酗酒；计划怀

孕、怀孕或哺乳。解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌研究对象纳入排除标准——以II型糖尿病研究为例Doi:10.1038/s41579-018-0029-9解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌iHMP——描述肠道微生态系统诊断和治疗炎症性肠病：样本收集、检测和数据生成流程从每个病人，收集了三种不同类型的样本：不同时间点粪便样本、定期活检组织和定期的血液样本。活检按临床指示采集，在临床检查中采集血液，粪便样本由参与者自行在家采集。多组学数据生成(主要是基于核苷酸序列和质谱)提供微生物、宿主和混合图谱，包括16S

rRNA基因检测、整个Metagenome和Metatranscriptome

shotgun序列、代谢物和蛋白质谱、单细胞分析、全病毒shotgun序列和血清学图谱。每个样本还附有临床(血液/活检)或环境、饮食问卷调查(粪便)

数据。解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌iHMP——2型糖尿病患者呼吸和其他应激状态下微生物和宿主的变化：样本收集、检测和数据生成流程在每次就诊时从每位患者收集血样和微生物组样品（包括鼻拭子、粪便和尿样）。

多组学数据生成（主要但不完全是基于核苷酸序列和质谱的）将提供微生物系统发育组成，宏基因组，宏转录组和宏蛋白质组的概况;

宿主蛋白质谱，细胞因子和自身抗体，以及全代谢组谱。

每个样本还收集临床（血液）或问卷调查的压力水平，环境和饮食（粪便和尿液）数据。解

螺

旋 | 陪

伴

医

生科

研

成

长知

识

金

牌人体微生态与免疫的因果和机制研究doi:10.1126/sciimmunol.aao1603在宿主-菌群互作中证明因果性菌群影响人体免疫性疾病的可能机制常见研究思路及案例详解02解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌人体微生态常见四种研究方案菌株水平（

strain-specific

）类似于GWAS分析，用多元统计学方法可以对肠道菌群种类组成、功能基因组成和宿主代谢表型的变化进行关联分析，目的是鉴定与疾病、表型相关的微生物物种、基因或代谢物质等。

该方法可以预测微生物组和疾病状态的关系。全微生物组关联分析（MWAS）可从物种、基因等水平探讨发病机制，可提供早期预警，在一定程度上为临床医生提供了辅助诊断的依据。生物标记物（biomarkers）微生物多样性、宏基因组、宏转录组三者结合可以在群落水平、DNA和mRNA水平上同时进行研究，实现多重角度互相验证，全面解析微生物环境群落。多组学研究（multi-omics）只有在菌株水平说明致病性机制才能

从复杂的因素中得到确切的对应关系。包含两层含义：①用单个菌株来研究

与疾病的关系，②致病性分析达到菌

株水平。发掘微生物与表型性状的关联性深入研究导致致病性的物种发掘潜在的基因或物种全面解析微生物群落功能CBAD解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌A.

生物标志物挖掘微生物生物标志物应用于精准医学，进行预测免疫治疗效果生物标志物的筛选，提供具有最大化临床效益的治疗方案进行微生物群落结构、功能和代谢产物与健康/疾病状况/结果的关联研究解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研成

长知

识

金

牌A.

生物标志物挖掘-案例1Multi-cohort

analysisofcolorectal

cancer

metagenome

identified

altered

bacteria

across

populations

and

universal

bacterial

markers结直肠癌宏基因组的多队列分析鉴定出在不同群体中改变的细菌和通用细菌标志物实验对象：中、美、澳、德法255位结直肠癌患者和271健康对照实验方法：粪便微生物宏基因组测序实验平台：Illumina

HiSeq

2000/2500主要结果：Meta分析共鉴定出结直肠癌粪便微生物中富集的7种细菌：脆弱拟杆菌、具核梭杆菌、不解糖卟啉单胞菌、微小小单胞菌、中间普雷沃菌、芬氏别样杆菌、食氨基酸热厌氧弧菌；以上7种细菌作为标志物可有效区分不同人群中结直肠癌患者和健康对照，

接收者操作特征曲线AUC为0.80（并入临床信息后AUC为0.88）；丰度相关性分析结果表明，结直肠癌富集、减少的细菌形成各自的共生网络；结直肠癌富集细菌与脂多糖、能量的生物合成途径相关IF：9.133解

螺

旋| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌Commensal

Bifidobacterium

promotes

antitumor

immunity

and

facilitates

anti–PD-L1

efficacy共生双歧杆菌促进宿主抗肿瘤免疫反应及抗PD-L1疗效实验对象：黑色素瘤小鼠模型实验方法：微生物多样性测序，16SrDNA

V4-V5实验平台：Illumina

MiSeq主要结果：具有不同共生菌群患黑色素瘤小鼠体内存在自发抗肿瘤免疫反应的差异，且这些差异在共同喂养或菌群移植后得到消除；16S

rRNA基因测序结果表明双歧杆菌与抗肿瘤作用相关；单独口服双歧杆菌可将肿瘤控制至与PD-L1特异性抗体疗法下相同的程度，并且二者组合治疗几乎消除了肿瘤生长；增强的树突细胞功能导致的肿瘤微环境中增强的CD8

+

T细胞的致敏和积累介导了该作用；结果表明，微生物群落的调控可能会调节癌症免疫疗效A.

生物标志物挖掘-案例2知

识

金

牌B.

菌株水平、代谢疾病多组学研究方案Zhang

C.,

et.al.

Genome

medicine.2016.样本收集粪便样本宏基因组血液收集临床表型尿液、血浆、粪悬液宏代谢组高深度测序、de

novo拼接组装基因丰度共丰度基因聚类基因组变异分析样本分析LC,LC-MS,GC-MS,NMR鉴定与疾病相关的代谢物质代谢物质和新陈代谢通路变化生理学状态：血糖内稳态FBS,FBI,OGTT,ITT体液内稳态TE,HDL,LDL,TC炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6，IL-10宿主新陈代谢内稳态、免疫解

螺

无旋

菌|

动陪物伴模医型生中科验研证成

长细菌基因组与代谢物质/表型相关性的统计分析鉴定特定基因组中功能基因样本收集与提取解

螺旋 | 陪

伴医

生

科

研

成

长知

识

金

牌案例-膳食纤维选择性富集的肠道细菌可缓解2型糖尿病签署知情同意书个人信息的问卷调查HbA1c和快速血糖的筛选检测空腹静脉血液样本粪便样本尿液样本膳食耐量试验人体测量以膳食为基础的进食频率问卷24-h饮食记录受试者

53名 资格筛查4名

放弃3名

不符合纳入标准1名

需进一步筛选49名受试者 受试者

53名 资格筛查受试者

32名

接受阿卡波 受试者

17名

接受阿卡波糖和WTP饮食 糖和常规治疗5名

放弃2名

不良事件 1名

放弃2名

违反协议 1名

生病1名

退出27名

完成实验 16名

完成实验纳入数据集 纳入数据集Gut

bacteria

selectively

promoted

by

dietary

fibers

alleviate

type

2diabetes实验设计高膳食纤维饮食基于2013年中国糖尿病学会T2DM指南进行患者教育和饮食建议解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌高膳食纤维饮食改善2型糖尿病患者的血糖、体重、血脂及肠道微生物群落结构糖化血红蛋白比例（衡量血糖总体控制情况的指标），

在起初都会出现明显下降，但从28天以后，W组的下降

水平会更加显著。糖化血红蛋白达标的患者比例，W组也明显高于U组（89%

vs

50%），此外W组的其他血糖指标、体重和血脂情况的改善也更好。空腹血糖，W组干预初期下降速水平更加显著。餐后血糖，W组干预初期下降速水平更加显著。在起初的28天，肠道菌群基因的丰富度明显下降（许多研究指出，菌群基因的高多样性通常预示着较高的健康状况），在28天后，W组的基因丰富度明显高于U组；并且在干预结束时的84天，两组的肠道菌群结构存在明显差异。解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌高纤维饮食改变2型糖尿病患者肠道细菌对碳水化合物的发酵CAZy家族基因丰度乙酸产生酶编码基因丁酸产生酶编码基因乙酸丁酸胰高血糖素样肽-1解

螺

旋 | 陪

伴

医知

识

金

牌膳食纤维饮食精确“钓”出15株缓解2型糖尿病的细菌79个菌株在高膳食纤维饮食后没有变化，47个发生显著降低，而还有15个菌株被富集，并在28天时达到最大。这15个菌株主要来源于三个门，在W组，15个菌株均可产生乙酸，其中5个还能产生丁酸，而在U

组，15个菌株中仅有3个可产生乙酸生的科菌研株成显长著增加，提示这15个菌株是高膳食纤维改善代谢的主要贡献者。解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌肠道菌群在基因水平上的变化降解碳水化合物(A)的基因的丰度，可以更好地反映与患者健康相关的菌群变化。干预后，参与淀粉(C)和菊粉(D)分解的基因在两组受试者肠道中均显著增加，

而参与利用果胶质(E)和黏液素(F)

的

基

因

则

均

显

著

减

少

。比较W组与U组发现，编码用于分解植物细胞壁多酶复合体衔接(G)和锚定部分的基因(H)仅在W

组干预后增加。解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌肠道菌群变化与改善2型糖尿病之间的“因果关联”：小鼠粪菌移植前后生理指标、菌群比较空腹血糖胰岛素口腔葡萄糖耐受测试 体重解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌Wang

J.,et.al.

Nature

Reviews

Microbiology.

2016.C.

MWAS（宏基因组关联分析）技术方案研究群体选择 样本取样宏基因组测序功能基因注释共丰度Genome

binning鉴定与疾病相关的因子验证：统计+实验实验对象：类风湿关节炎患者、健康对照粪便、牙齿及唾液样品实验方法：宏基因组测序实验平台：Illumina

HiSeq

PE100主要结果：肠道、口腔微生物组间存在一致性，表明不同身体部位物种丰度和功能存在重叠；类风湿性关节炎患者肠道、口腔菌群失调，治疗后可部分恢复；区别于健康对照，RA患者肠道、牙齿或唾液微生物组的改变与临床指标相关，因此可据其对治疗的响应用于个体分层；嗜血杆菌于RA患者中缺乏，且与血清自身抗体水平呈负相关；RA患者唾液乳杆菌的丰度增加，特别是RA病情非常活跃时；RA患者微生物群铁、硫、锌和精氨酸的氧化还原环境、转运和代谢相关功能发生改变；同时检测到菌群对RA相关抗原的分子模拟解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌案例-MWAS研究中国人群类风湿性关节炎The

oral

andgut

microbiomesare

perturbed

inrheumatoid

arthritis

and

partly

normalized

aftertreatment类风湿性关节炎患者口腔和肠道微生物组失调且治疗后得到部分恢复212份

粪便样本77名

未治疗

VS

80名

对照17名

未治疗

VS

17名

亲属21名

DMARD-治疗98份

唾液样本51名

未治疗47名

对照宏基因组测序分类学注释

物种丰度分析全基因组相关分析（MGWAS）KEGG功能分析105份

牙齿样本54名

未治疗51名

对照解

螺

旋

|

陪伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌KEGG功能分析病人三个部位（肠道，牙齿及唾液）菌群失衡情况RA患者脂多糖生物合成等相关KEGG模块相对富集；RA患者乙酰辅酶A还原途径相对富集；与健康对照相比，RA患者肠道菌群失调解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌RA患者及健康对照口腔（齿龈和唾液）中基因连锁群（MLG）网络图RA患者与健康对照齿龈富集MLGs RA患者与健康对照唾液富集MLGs通过RA患者于对照口腔样本MLGs分析，得到RA中富集的MLGs、微生物分类群；尽管口腔微生物受到饮食、口腔卫生等因素影响，但是RA患者口腔微生物组与健康对照相比有所偏离解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌肠道菌群与口腔微生物关系基因连锁群（MLG）网络图肠道与牙齿MLGs相关分析肠道与唾液MLGs相关分析RA患者口腔、肠道等不同位点细菌存在共变化趋势解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌粪便与口腔（齿龈、唾液）基因连锁群（MLG）对RA预测牙齿样本唾液样本粪便样本AUC：粪便样本0.94牙齿样本0.87唾液样本0.81解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌D.

多组学技术方案环境微生物样本16S/18S/ITS测序物