微生物系列专题04微生物多样性测序分析流程及常见结果解读

®微生物多样性分析流程及常见结果解读解

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长知识金牌01常见分析结果解读02CONTENTS课程目录微生物多样性测序基础知识微生物多样性测序基础01解

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长知识金牌16S

rDNA是最常用的细菌分类标准。通过对指定环境中微生物16S

rDNA高变区PCR扩增产物进行高通量测序，分析该环境下微生物群落的多样性，包括物种的分类信息和丰度信息等。研究对象：特定环境中细菌或古细菌。16S

rDNA

的结构特点0

100

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800V1V2V3V4V5V6V8V7V9900

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1500338F806R515F806R微生物多样性测序简介——16S

rRNA基因测序技术路线DNA抽提和质检PCR扩增文库构建和质检Illumina

Miseq2X300bp测序数据分析解

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长知识金牌18S

rDNA/

ITS是常用的真菌分类标准，指定环境中真菌的高变区的扩增产物进行高通量测序，反映不同样本的物种间差异，分析该环境下微生物群落的多样性，包括物种的分类信息和丰度信息等。研究对象：特定环境中真微生态落。18S

rDNA

的结构ITS的结构微生物多样性测序简介——18S

rRNA/ITS基因测序解

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长知识金牌分类注释数据库类常用软件及数据库分析软件统计作图软件图形编辑软件解

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长知识金牌分类学注释数据库简介数据库名称侧重分类链接SILVABacteria，Achaea,

Eukarya16S/18S,

SSU，23S/28S,

LSUhttps://www.arb-silva.de/RDPBacteria，Achaea16S

rRNA（Bacterial

and

Archaeal）

,

and

28SrRNA（Fungal）/index.jspGreenGeneBacteria，Achaea16S

rRNA/

NCBItaxdmpBacteria，Achaea,

Eukarya,Virus/guide/taxonomy/UNITERoot-associated

fungiITShttps://unite.ut.ee/repository.phpPR2Eukarya18S/FunGenefunctional

genefunctional

geneeHOMDhuman

oral

microbiome

database/index.php解

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长知识金牌一般分析流程解

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长知识金牌Reads名称测序得到的Reads序列Reads每个碱基的

质量分数，以ASCII码表示。Miseq

PE300测序序列说明Illumina平台测序得到是双端序列数据，首先根据PE

reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接（merge）成一条序列，同时对reads的种类和拼接的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样本得到有效序列。常见分析结果解读02解

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长知识金牌OTU（OperationalTaxonomicUnits，操作分类单元）是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志，是一个假定的运算分类单元OTU

ID各样本OTU数目各OTU物种分类OTU聚类与注释分析-OTU及各分类学水平统计表解

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长金知

识

牌α-多样性分析-多样性指数分析群落生态学中通过单样本的多样性分析（α-多样性）反映微生物群落的丰度和多样性菌群丰度（Community

richness）指数：Chao;Ace菌群多样性（Community

diversity）指数：Shannon;Simpson测序深度指数：Coverage样本名称分入所有OTU中的总优化序列数本次实验该样本优化序列划分得到的OTU数目相似性水平为0.97各个多样性指数解

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长知识金牌α-多样性分析-Shannon-Wiener曲线随机取样数Shannon-Wiener曲线：利用各样本的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性曲线趋向平坦，说明测序数据量足够大，足以反映样本中绝大多数的微生物信息统计学中的下限和上限值随机抽取的测序数据量微生物多样性指数解螺

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陪金知

识

牌α-多样性分析-多样性指数比较箱线图多样性指数比较箱线图：不同分类或环境的多组样本多样性指数进行四分位计算，比较不同样本组的组间多样性指数差异可同时采用非参数Mann-Whitney或Wilcoxon检测判断样本组间差异的显著性样本分组伴医生科研成长α-多样性指数差异显著性水平最大值四分位中位数四分位最小值解

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长知识金牌β-多样性分析-PCA分析β多样性是对不同样本/不同组间样本的微生物群落构成进行比较分析。主成分分析(Principal

Component

Analysis，PCA)：应用方差分解对多维数据进行降维，从而提取出数据中最主要的元素和结构样品群落组成越相似，PCA图中样品点间的距离越小不同颜色或形状的点：不同环境或条件下的样本组横、纵轴刻度：相对距离，无实际意义PC1、PC2：对于两组样本微生物组成发生偏移的疑似影响因素解

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成长金知

识

牌β-多样性分析-PCoA分析主坐标分析（PrincipalCo-ordinatesAnalysis，PCoA）与PCA类似，通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构的一种降维排序方法基于Bray_Curtis、Weighted

Unifrac距离和Unweighted

Unifrac距离进行PCoA分析，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示样品距离越接近，物种组成结构越相似解

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|知识金牌PCA,PCOA（基于Bray_cutrtis,Unweighted

Unifrac,Weighted

Unifac）及Nmds分析的比较数据来源对照组、两个不同时期的处理组。对于Con组，由于是背景完全一致的小鼠，故肠道菌群的类型是基本相同的（即菌的进化关系较一致），Unweighted

UniFrac考虑物种的进化关系及物种有无的变化，所以对于Con组，样本间距离更近；而A组和B组样本所用的处理方法比较剧烈，所以不论从菌的类型（菌的进化关系）及丰度上均发生很大的改变，所以Bray_cutrtis,Unweighted

Unifrac两种算法都能较好的区分。陪伴医生科研成长解

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长知识金牌β-多样性分析-Adonis多因素方差分析Adonis多因素方差分析：利用半度量（如Bray-Curtis)或度量距离矩阵(如Euclidean)对总方差进行分解，分析不同分组因素对样品差异的解释度，并使用置换检验对划分的统计学意义进行显著性分析结合PCoA分析结果，用以判断样本分组是否有意义R2

-表示不同分组对样品差异的解释度，即分组方差与总方差的比值，即分组所能解释的原始数据中差异的比例，R2越大表示分组对差异的解释度越高Pr(>F)-通过置换检验获得的P值，P值越小，表明组间差异显著性越强分组自由度总方差平均方差F检验值不同分组对样品差异的解释度置换检验P值解

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陪伴医生科研成长知识金牌物种组成分析-优势物种相对丰度根据OTU注释结果分别在各分类水平统计各样本的物种相对丰度并作优势物种相对丰度图，以反映微生物种类及其相对丰度根据各物种间spearman相关性距离进行聚类根据Bray-Curtis距离算法进行样本聚类解

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长知识金牌样本间差异分析-Wilcoxon秩和检验分析Wilcoxon秩和检验分析（Wilcoxon

rank-sum

test）：曼-惠特尼U检验（Mann–Whitney

U

test），能够进行两组独立样本非参数检验通过对两组样本平均秩的研究实现判断两总体的分布是否存在差异，对两组样品的物种进行显著性差异分析，并对P值计算假发现率（FDR）q值平均相对

平丰度

度均相对丰 平均相对 平均相对丰标准差 丰度 度标准差

概率值 假发现率PH解

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长知识金牌样本间差异分析-LEfSe线性判别分析LEfSe（LDA

Effect

Size）：用以发现基因、代谢和分类等高维生物标识和揭示基因组特征，用于区别两个或两个以上生物条件或类群方法：通过non-parametric

factorial

Kruskal-Wallis(KW)sum-rank

test）检测具有显著丰度差异特征，并找到与丰度有显著性差异的类群；线性判别分析（LDA）来估算每个组分（物种）丰度对差异效果影响的大小统计各个组中有显著作用的微生物类群通过LDA分析（线性回归分析）后获得的LDA分值节点大小：丰度默认从门到属依次向外排列不同颜色区域：不同分组红色节点：红色组别中起到重要作用的微生物类群绿色节点：绿色组别中起到重要作用的微生物类群黄色节点：两组中均没有起到重要作用的微生物类群解

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长知识金牌RDA/CCA分析冗余分析（Redundancy

analysis，RDA）/典型相关分析（Canonicalcorrespondenceanalysis，CCA）主要用来反映环境因子、样本、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系，其中RDA基于线性模型，CCA基于单峰模型数字：样本名不同颜色或形状：不同环境或条件下的样本组箭头：环境因子物种与环境因子间夹角：物种与环境因子间相关关系（锐角：正相关；钝角：负相关；直角：无相关）不同样本向各环境因子做垂线，投影点越相近说明样本间该环境因子属性值越相似，即环境因子对样本的影响程度相当解

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长知识金牌相关性分析Heatmap图相关分析：用来分析变量之间的相关关系及其显著性，相关性系数和显著性P值可同时在Heatmap图中展示（常见的如spearman相关性）色块：相关性系数大小（范围-1~1）***：P值小于0.01**：P值小于0.05,*：P值小于0.1解

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