科研公开课文献精读（四）

科研公开课：文献精读（第四讲）医盟讲师：魏晓为南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）本节主要内容文献精读在课题设计的实际应用选题设计实验观察资料数据分析总结提出假设研究结果检验假设科研的基本程序文献精读选题的重要性什么是文章的第一吸引力？选题新颖性权威性领域性实用性可以当你遇到一个普通的选题时？维生素C、前列腺癌（2014.09）一周给出课题初步设想1、不要抱怨课题的普通2、关键看你怎么想、怎么做多角度思考问题、多角度探索出路维生素C前列腺癌治疗还原型氧化型放疗保护无效化疗文献精读寻找思路争议由来昙花一现的研究：

1978年PNAS发文每日10g维生素C口服显著改善肿瘤终末期患者生存期，评估延长约300天诺贝尔奖获得者：莱纳斯·鲍林（Linus

Pauling）后续临床研究未能复制相关结果静脉VS口服，沉寂中的突破VitaminC

pharmacokinetics:

Implications

for

oral

and

intravenous

use.Ann.

Intern.Med.

140,533–537

(2004)

静脉维生素C的血药浓度显著高于口服，这在高剂量使用时尤为明显

维生素C的给药方式显著影响其药理学功能大量研究发现高剂量维C的抗癌作用初步总结1、维生素C在肿瘤治疗中历史悠久，争议明显（有争议就有空间）2、高剂量维生素C是目前研究的方向（

明确用药）3、大多数研究集中于维生素C的抗癌效果，但临床数据不佳（单纯抗癌研究无新意）4、有放化疗增敏性报道（临床意义明显，有研究空间）高剂量维生素C的放化疗增敏，为什么选择放疗？1、前列腺癌放疗敏感，临床契合度高（极其重要）应用基础研究，重在实用性、可转化性关注集中于临床常见问题的解决课题申请的适用性、倾向性高剂量维生素C的放化疗增敏，为什么选择放疗？2、放疗、化疗的已有研究不对等性高剂量维生素C的放化疗增敏，为什么选择放疗？3、维生素C、放疗、前列腺癌，仅有一篇报道，发展空间巨大选题的基本原则针对性原则：前列腺癌放疗增敏，临床意义显著可行性原则：实验室条件、时间、人力符合创新性原则：研究极少，创新性好，可塑性强第二步、验证假设选题提出功能假说功能验证提出机制假说机制验证功能验证高剂量维生素C在前列腺癌中的放疗增敏作用实验方法：MTT，克隆形成实验目标：前列腺癌细胞株（至少两种以上，越多越好）前列腺上皮细胞（至少一种）治疗性研究强烈建议有正常、异常组织对照实验条件：细胞密度、剂量、时间等等要素化阅读：相关文献的methods精读高剂量维C对肿瘤细胞的选择性杀伤高剂量维C的放射增敏及放射保护作用放射增敏放射保护？问题一：如何定性增敏及保护？Combination

Index

(CI)问题二：药物的评价公式是否适用于放疗？文献的检索与精读提供证据支持增敏减毒的双重效果第三步：机制假设综述阅读了解研究现状及相关主要机制获取信息如下1、维生素C是公认的抗氧化剂，但在高剂量下是促氧化剂2、高剂量维生素C主要通过产生过量H2O2、O2-促进ROS水平升高1、可能的机制2、潜在的实验检测指标ROS的肿瘤致死及适应性生存理论高剂量维生素C的潜在作用机制？评估高剂量维生素C对细胞内H2O2水平的干预结果显示：1、肿瘤细胞环境ROS水平明显高于正常细胞株2、高剂量维C显著提高了肿瘤细胞环境ROS水平，而在正常细胞提升有限机制假说验证评估高剂量维生素C对细胞内O2-水平的干预机制假说验证分子机制探索1、文献检索，关键词：氧化应激、前列腺癌、放疗抵抗RelB在前列腺癌放疗抵抗中发挥重要作用RelB在前列腺癌中特异性高表达研究显示RelB参与ROS调控诱导放疗抵抗，是前列腺癌放疗抵抗的重要机制之一新机制：维生素C对RelB的选择性抑制1、高剂量AA抑制肿瘤细胞内RelB蛋白及基因水平，但对RelA水平影响较小2、高剂量AA促进正常细胞内RelB蛋白及基因水平，但对RelA水平影响较小问题：为什么要测RelA？证据的严谨性：蛋白家族一定要注意同类蛋白的功能交叉，避免结果的偏倚文献的充分阅读知己知彼、百战不殆问题：上述结论是否完整？不完整表达功能1、蛋白的功能一定是我们需要明确的指标2、功能的验证一定要有现象级证据的论证新机制：维生素C对RelB的选择性抑制高剂量AA明显抑制癌细胞内RelB转录活性（图B），抑制RelB表达明显提高AA的抗癌敏感性，而促进RelB表达则明显抑制了AA的抗癌作用（图C)思路及数据总结AARelB ROSRelBROS放疗抵抗放疗增敏创新点三分文章足以，5分以上文章不足故事要讲完整，情节还不够曲折、角色结局还不清晰思路及数据总结AARelBROSRelBROS放疗抵抗放疗增敏？？？？线粒体下一步思路方向1、了解AA通过何种机制调控RelB2、了解AA调控RelB，随后通过何种机制影响ROS生成（线粒体）文献检索明确方向通过文献检索发现RelB的调控研究极少，且与本研究无法关联（第一条思路从可行性角度否定，并非是现实否定）RelB影响ROS生成（线粒体），文献报道较多，常见靶点MnSOD新的发现，AA可抑制细胞能量代谢（线粒体）思路拓展线粒体是ROS生成中心，能量代谢紊乱与氧化应激密切相关RelB与能量代谢的研究较少，RelB与线粒体的直接研究较少我们进一步研究目标确认：RelB与线粒体功能的关系AA与线粒体能量代谢的验证RelB下游信号通路的探索高剂量维生素C通过调控转录因子RelB参与前列腺癌放疗抵抗及正常组织放疗保护。但其下游信号通路是什么？RelB通过何种机制参与线粒体功能发挥ROS调控功能呢？文献检索、文献精读寻求灵感、思路、突破口文献检索的重点、精读的方向主要关键词：线粒体、ROS，肿瘤泛读到精读的逐层筛选、排除、鉴定目标蛋白：在功能中的代表性在领域中的关注性

在学术中的新颖性

与RelB之间的未知性在充足的证据支撑下，发挥想象的空间、摸索与尝试线粒体功能蛋白SIRT家族的确定新颖度、关注度、潜在前景线粒体功能蛋白SIRT3SIRT3是维持线粒体内稳态的关键去乙酰化酶，

可对外界应激产生迅速

应答并稳定线粒体功能。SIRT3参与线粒体多种能量代谢途径，包括能量代谢及ROS的清除SIRT3在肿瘤发生发展及治疗抵抗中发挥重要作用高剂量AA与SIRT3与RelB类似，高剂量AA选择性调控SIRT3基因及蛋白表达基因转染及基因沉默技术显示，RelB表达与SIRT3密切相关Vitamin

Chigh

ROS

levelrelB

suppressionSIRT3mitochondria

disfunctionlow

glucose

levelATP

synthesis

decreasedNAD+

regeneration

suppressed潜在机制设想NAD+respiratory

electron

chainSIRT1inactivationNormalconditionNAD+

consumption

increasedNAD+depletionRelB与SIRT3的关联RelB是转录因子，SIRT3是功能蛋白，我们需要证明的就是SIRT3是否受到RelB直接转录调控或间接调控难点：寻找SIRT3启动子序列中RelB的潜在结合点，设计引物，验证设想寻找RelB潜在结合位点转录调控的检测方法CHIP（文献的检索确认其技术的先进性和认可度）双荧光素酶报告基因实验（Luciferase

Assay）RNA

干扰及基因过表达技术扰动RelB

表达，RT-PCR、Western

blot

确认RelB

差异表达对SIRT3

基因、蛋白表达的影响Mechanismstudy-

fromRelBto

SIRT3RelBbinding

site

inSIRT3promotorregion第四步、功能及机制验证体内的功能及机制验证相比于细胞的人工环境，动物模型的生物环境数据更有说服力体内研究的数据是提升文章逻辑性、科学性的重要部分参考高质量文章的动物建模、药物剂量、数据测定、统计方法、评价体系，减少工作的失误动物模型的借鉴数据分析及统计方法的参考动物实验结果验证荷瘤裸鼠实验显示相比单纯治疗组，AA联合IR组生存期显著延长动物实验进一步验证AA调控RelB-SIRT3信号通路参与肿瘤放疗增敏及正常组织放疗保护第五步：学习高质量文