DB37T 3128.1-2018 群禽腺病毒感染诊断技术 第1部分：病毒分离鉴定

DB37/T3128.1—2018l群禽腺病毒感染诊断技术第1部分：病IDB37/T3128.1—2018本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、窦砚国、郑肖强。1DB37/T3128.1—2018l群禽腺病毒感染诊断技术第1部分：病毒分离鉴定1范围本标准规定了I群禽腺病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。荧光试验(IFA)适用于上述病毒的检测、限制性片段长度多态性分析(RFLP)适用于对I群禽腺病毒12种血清型病毒的鉴定。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫下列定义和术语适用于本文件。种血清型。3.2间接免疫荧光试验Indirect用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光信号为阳性反应。3.3利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，用于检测DNA序列多态性。3.42鸡胚肝癌上皮细胞系，来源于雄性鸡肝脏肿瘤。电泳检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。用收集处，并通过适当的方式(如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司)进行无害化处理。用垃圾处理公司做最终处理。4.2人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。a)生物安全柜；b)PCR仪；c)CO₂恒温培养箱(37℃恒温);d)台式低温高速离心机(最大转速12000r/min);e)电泳仪；j)微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头；k)孵化器(37℃恒温);n)电磁炉或微波炉；除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。b)细胞培养液(含10%血清的DMEM培养基);c)细胞维持液(含1%血清的DMEM培养基);d)甲醇：丙酮(1:1)固定液；e)抗体稀释液PBST,见A.2;3f)商品化的FITC标记鼠抗兔荧光抗体；g)兔抗I群禽腺病毒多克隆抗体(灭活疫苗免疫兔制备);m)商品化的DNA分子量标准，要求在100bp～2000bp之间，有5条以上的指示条带；o)1×TAE缓冲液，见B.2;q)核酸电泳加样缓冲液，见B.4;y)Hexon基因扩增引物。FAV-AF:5'-TGGACATGGGGGCGACCTA-3';FAV-BF:5'-AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3';5.2.1室温条件下样品在1h~2h内处理完毕，未能及时处理的样本在4℃冰箱中存放，不超过24h;也可于-20℃低温条件下保存，不超过30d;-70℃贮存最佳，不超过1年。5.2.2组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20℃低温条件下保存，不超过2周；-70℃贮存不超过5.3.1在生物安全柜中，取1IU/mL)等渗磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.0~7.4,附录A.1)配成10%～20%(g/mL)的悬液；泄殖腔拭子悬液中抗生素浓度提高5倍。加入抗生素后pH调至7.0～7.4。4DB37/T3128.1—20185.3.35.3.3样本组织悬液反复冻融3次，经8000r/min离心10min,取上清并置4℃过夜，次日接种SPF鸡胚或LMH细胞系。6.1鸡胚接种6.1.1将处理后的样品上清，每份尿囊腔接种(3枚~5枚)9日龄~11日龄SPF鸡胚，0.2mL/胚，置于孵化器中，37℃孵化120h。6.1.2弃去24h内死亡胚，24h~120h内死亡和存活鸡胚置4℃冰箱过夜或-20℃冷冻1h,分别无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。6.2细胞接种6.2.1将处理后的样品上清接种单层LMH细胞，孵育1h,吸弃上清，用PBS缓冲液轻轻洗涤2次，吸弃后加入细胞维持液。6.2.270%以上单层细胞出现细胞病变时，将细胞培养物冻融后，转移至冻存管置于-70℃保存，不超过3年。7.1间接免疫荧光法(IFA)缓冲液轻轻洗涤3次~4次，吸弃液体。每孔加入用-20℃预冷的甲醇：丙酮(1:1)固定液150μL,置于-20℃孵育10min,吸弃固定液。干燥后用PBS缓冲液洗涤7.1.2一抗孵育用抗体稀释液(PBST,见附录A.2)将兔抗工群禽腺病毒多克隆抗体作1:200倍稀释，每孔加入100μL,置于湿盒中，37℃孵育1h。吸弃后用PBS洗涤3次。7.1.3二抗孵育避光条件下，用PBST将FITC标记鼠抗兔抗体作1:200倍稀释，每孔加入100μL,置于湿盒中，37℃孵育1h。吸弃后用PBS洗涤3次。7.1.4封片观察加入数滴50%甘油(附录A.3)封片，置于荧光倒置荧光显微镜(FITC荧光目镜)下，观察是否出现绿色荧光信号。7.2限制性片段长度多态性(RFLP)分析7.2.1DNA的提取510×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,上游引物(50μmol/L)和下游引物(50当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，停止电泳。将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下观按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对阳性条带回收、纯化，溶解于30μLddH20中。测定核酸浓度，确保核酸浓度≥10ng/μL。反应体系：PCR产物(片段A或B)17μL、10×缓冲液2μL、HaeⅡ限制性内切酶1μL,总体积为20μL。反应条件：37℃孵育1h,72℃作用5min。取酶切产物9μL,按照7.2.4的步骤进行琼脂糖凝胶电泳。7.2.11对照设置每次检测，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品(LMH细胞),至少设置一个或一个以上的8结果判定8.1LMH细胞感染I群禽腺病毒，细胞肿胀变圆，呈葡萄串状，细胞间隙增大，IFA检测出现绿色荧光信号。在阳性对照出现绿色荧光信号，阴性对照无条带出现(引物二聚体除外)时，检测样品阳性的表明样品中存在I群禽腺病毒，阴性样品中无I群禽腺病毒。68.2阳性对照接种细胞出现细胞病变，IFA检测显示胞浆出现绿色荧光信号(附录C),阴性对照无细胞病变，胞浆未出现绿色荧光信号时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，阳性样品用于病毒的血清型鉴定。8.3以阳性样品培养物的