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文档简介

DB37猪附红细胞体PCR检测技术IDB37/T3086—2017本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。1DB37/T3086—2017猪附红细胞体PCR检测技术实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法SDS十二烷基硫酸钠。5.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。5.1.9烧杯(1000mL)。2DB37/T3086—20175.1.10电子天平精度为：0.001g。5.1.132℃~8℃冰箱。5.2试剂5.2.1蛋白酶K(见附录A.1)。5.2.210%SDS液(见附录A.2)。5.2.370%乙醇(见附录A.3)。5.2.41.0%琼脂糖凝胶(见附录A.4)。5.2.6超纯水：符合GB/T6682,三级。MS-Fwd:5-CGAGCGCAACCCTTCATAT-3;MS-Rev:5-CTACCATTGTAGCACGTTTGCA-3;6操作程序临床上猪的血液(肝素抗凝血),置于2℃~8℃冰箱保存。6.1.2样品的处理6.1.2.1取肝素抗凝血液约5ml。6.2DNA的提取6.2.1取肝素抗凝血500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的6.2.2加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min。6.2.3取上清于一新的离心管中，加入200μLTris饱和酚和200μL氯仿，10000g离心15min。6.2.5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min,10000g离心15min,弃上清。6.2.6加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。6.2.7加入100μL灭菌双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用。试验中同时设立猪附红细胞体DNA作为3DB37/T3086—2017表1PCR反应体系(50μL)序号体系组成体系含量1灭菌双蒸水2DNA310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7Taq酶瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95℃5min,94℃30s,52℃45s,72℃1min,循环30次，72℃延伸10min结束。6.4.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录A.4。7.1在阳性对照出现127bp扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立(参见附录A.5)。胞体阴性(参见附录A.6)。4DB37/T3086—2017A.1蛋白酶K溶液(20mg/mL)试剂名称用量蛋白酶K灭菌双蒸水试剂名称

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