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文档简介

DB37IDB37/T3087—2017本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。1实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫5.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。5.1.220000r/min低温高速离心机。2DB37/T3087—20175.1.9烧杯(1000mL)。5.1.142℃~8℃冰箱。5.2试剂除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。5.2.1蛋白酶K(见附录A.1)。5.2.210%SDS液(见附录A.2)。5.2.370%乙醇(见附录A.3)。5.2.41.0%琼脂糖凝胶(见附录A.4)。PRV-Fwd:5-CTGGCTCTGCGTGCTGTG-3;PRV-Rev:5-GGTCCATTCGTCACTTCCG-3;扩增片段长度348bp。6操作程序临床上猪的脑组织、淋巴结等，置于-20℃冰柜或液氮中保存。6.2DNA的提取用蛋白酶K裂解法提取总DNA。6.2.1取研磨液500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的SDS溶6.2.5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min,10000g离心15min,弃上清。3DB37/T3087—2017序号体系组成体系含量1灭菌双蒸水2DNA310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7Taq酶瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95℃5min,94℃30s,60℃45s,72℃循环30次，72℃延伸10min结束。6.4电泳6.4.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录A.4。7.1在阳性对照出现348bp扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立(参见附录A.5)。7.2被检样品出现348bp扩增带判定为伪狂犬病病毒gE基因阳性，未出现相应扩增带的样品判定为伪狂犬病病毒gE基因阴性(参见附录A.6)。4DB37/T3087—2017A.1蛋白酶K溶液(20mg/mL)试剂名称用量蛋白酶K灭菌双蒸水试剂名称用量十二烷基硫酸钠灭菌双蒸水浓盐酸调pH至7.2灭菌双蒸水加至100mL试剂名称用量无水乙醇灭菌双蒸水试剂名称用量琼脂糖0.5×TBE缓冲液5DB37/T3087—2017348bpA.6检测样品

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