DB31-T 955-2022 猪圆环病毒3型实时荧光PCR 检测方法

代替DB31/T955—2015猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法上海市市场监督管理局IDB31/T955—2022 12规范性引用文件 1 1 2 2 2 3 3附录A(规范性)溶液配制 5附录B(规范性)引物和探针 6附录C(规范性)DNA提取方法 7 8本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件代替DB31/T955—2015《猪圆环病毒2a/2b亚型实时荧光PCR检测和分型方法》,与——增加了耗材(见第6章);——更改了试剂(见第7章，2015年版的第6章);——增加了粪便样品采集方法(见第8章);——删除了注意事项(见2015年版的第9章);——更改了附录A(见附录A,2015年版的第6章);——更改了DNA提取方法(见附录C,2015年版的附录A);——增加了荧光PCR反应体系(见附录D)。本文件由上海市农业农村委员会提出并组织实施。本文件由上海市畜牧业标准化技术委员会归口。本文件所代替文件的历次版本发布情况为：——DB31/T955—2015。H11范围猪圆环病毒3型porcinecircovirustype3;PCV3从起始密码子开始，是DNA序列中具有编码蛋白质潜能的4原理5.1荧光PCR仪。5.4高速台式冷冻离心机：可控温至4℃,离心力可达12000r/min以上。25.6普通冰箱：2℃~8℃。7.3DNAzol,商品化DNA抽提试剂，于2℃~8℃保存。用健康猪的组织材料。3DB31/T955-20228.2.1血清样品：用真空采血管采集受检猪静脉血2mL,室温或者37℃8.2.3拭子样品：用无菌棉拭子反复刮擦呼吸道黏膜5次~10次，蘸取分泌物后将棉拭子放入5mL30s,吸取不少于0.5mL上清液至新的1.5mL无菌离心管内备用。过24h,-18℃及以下可以稳定保存3个月，-70℃及以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行8.4.3粪便样品：5000r/min离心10min,吸取1mL上9DNA提取4在检测区进行。将10.3离心后的PCR管放入荧光PCR检测仪中，设置报告荧光为5(规范性)溶液配制6(规范性)引物和探针引物、探针的名称和序列见表B.1。表B.1引物、探针的名称和序列名称序列PCV3-F1(上游引物)PCV3-R1(下游引物)PCV3-P1(探针)5'-HEX-TACGATAAACAACTGGACCCCG7(规范性)DNA提取方法C.1在核酸提取区操作。DNA抽提使用DNAzol试剂提取，也可以使用等效商品化试剂盒提取。C.2取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行C.3每管先加入800μLDNAzol,再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL,颠倒10次混匀，2℃~8℃10000r/min离心10min。2℃~8℃10000r/min离心5min。C.5弃上清液，沿管壁缓缓加入1mL75%乙醇，颠倒混匀3次~6次，2℃~8℃10