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DB37DB37/T2995—2017副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术山东省质量技术监督局发布IDB37/T2995—2017本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：吴家强、于江、郭立辉、张玉玉、杜以军、李俊、陈蕾、陈智、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。本标准为首次发布。1DB37/T2995—20171范围件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法4缩略语HPS:副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)5.3荧光定量PCR仪。5.4水浴锅。5.6-20℃冰箱。5.10一次性无菌5mL注射器。2DB37/T2995—20175.120.2mLPCR薄壁管或八联管。5.14SYBRGreenI核酸染料(含酶)。5.15蛋白酶K(见附录A.1)。5.1610%SDS液(见附录A.2)。5.1770%乙醇(见附录A.3)。6方法6.1样品采集6.1.3细菌培养物：37℃培养24h～48h的细菌培养物。6.2.1组织样品处理：取肺脏组织3g~5g于研钵中，用灭菌剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研6.2.2细菌培养物处理：挑取3~4个细菌单菌落加入100μL灭菌水中，煮沸10min后，再放置-20℃冻结。冻融后，10000r/min6.3.1取样品500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的SDS溶液25μL,55℃水浴2h～3h。6.3.5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静止20min,10000r/min离心156.3.6加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。6.4荧光定量PCR反应体系6.5荧光定量PCR程序设定7结果判定3DB37/T2995—20177.1.2阳性对照Ct值<30,并出现特定扩增曲线，否则，此试验视为无效。7.2判定Ct值>35,表明样品为阴性。4DB37/T2995—2017灭菌双蒸水(资料性附录)试剂的配制十二烷基硫酸钠灭菌双蒸水浓盐酸灭菌双蒸水无水乙醇灭菌双蒸水70mL30mL5DB37/T2995—2017组分反应体系SYBRGreenI核酸染料引物P1引物P2DNA模板2.0μL灭菌水8.5μL总量25.0μL表B.2

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