常见化学发光免疫分析关键技术比较

常用化学发光免疫分析技术比较

1、化学发光免疫分析

化学发光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay,CLIA）,

英音：[,kemi,lju:mi'nesans][,imju:n0uo*sei]

是将具备高敏捷度化学发光测定技术与高特异性免疫反映相结

合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药

物等检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间

辨别荧光免疫分析之后发展起来一项最新免疫测定技术。

CLIA是将具备高敏捷度化学发光测定技术与高特异性免疫反映

相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素

和药物等检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和

时间辨别荧光免疫分析之后发展起来一项最新免疫测定技术。

1.1、化学发光免疫分析原理

化学发光免疫分析包括两个某些，即免疫反映系统和化学发光分

析系统。化学发光分析系统是运用化学发光物质经催化剂催化和氧化

剂氧化，形成一种激发态中间体，当这种激发态中间体回到稳定基态

时，同步发射出光子（hv）,运用发光信号测量仪器测量光量子产额。

免疫反映系统是将发光物质（在反映剂激发下生成激发态中间体）直

接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析）上，

或酶作用于发光底物。

1.2、化学发光免疫分析类型

化学发光免疫分析法以标记办法不同而分为两种：

⑴化学发光标记免疫分析法；

⑵酶标记、以化学发光底物作信号试剂化学发光酶免疫分析法

1.2.1化学发光标记免疫分析

化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CLIA),是用化

学发光剂直接标记抗原或抗体免疫分析办法。惯用于标记化学发光物

质有口丫咤酯类化合物・acridiniumester(AE),是有效发光标记物，其

通过起动发光试剂(NaOH-HzCh)作用而发光，强烈直接发光在一秒

钟内完毕，为迅速闪烁发光。口丫咤酯作为标记物用于免疫分析，其化

学反映简朴、迅速、不必催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分

子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子结合不会

减小所产生光量，从而增长敏捷度。

1.2.2化学发光酶免疫分析

从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析(chemiluminescent

enzymeimmunoassay,CLEIA),应属酶免疫分析，只是酶反映底物

是发光剂，操作环节与酶免分析完全相似：以酶标记生物活性物质(如

醮标记抗原或抗体)进行免疫反映，免疫反映复合物上酶再作用于发

光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。

当前惯用标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP),它

们有各自发光底物。

12.2.1HRP标记CLEIA

惯用底物为鲁米诺(3•氨基邻苯二甲酰肿,luminol),或其衍生物

如异鲁米诺(4.氨基邻苯二甲酰脱)，是一类重要发光试剂。其构造如

图4所示。鲁米诺氧化反映在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及

活性氧［过氧化阴离子(0,，单线态氧(102),羟自由基(0H・),

过氧化氢(H2O2)］存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，

其波长为425nm。

初期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体)，但标记后发光强度减少

而使敏捷度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反映后

运用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂(N

aOH-H2O2)作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于防免疫反映物中酶

浓度。KodakAmerliteTM半自动分析系统就是运用这一体系专门设

计。

1.2.2.2增强发光酶免疫分析(enhancedluminescenceenzyme

immunoassay,ELEIA)

在发光系统中加入增强发光剂，如对2碘苯酚等，以增强发光信

号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析敏捷度

和精确性。在全自动分析仪上，还可通过计算机严密控制，进行自动

操作，如加试剂，混合，温育，洗涤，加发光试剂，发光计数，数据

解决，绘制原则曲线，直至完毕病人血清样品分析并打印出成果。

AmerliteTM发光增强酶免分析系统用荧光素、噬唾等增强剂，其发

光时间可持续长达20min,试剂盒有甲状腺功能检测促甲状腺素、三

碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素，与

性激素关于有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎

蛋白、雌二醇、睾酮，以及其她方面如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。

1.2.2.3ALP标记CLEIA

所用发光底物为环1，2.二氧乙烷衍生物,，用于化学发光酎免分析

底物而设计分子构造中包括起稳定作用金刚烷基，其分子中发光基团

为芳香基团和酶作用基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发

光。最常使用底物AMPPD3-[2-spiroadamatane]-4-methoxy

-4-[3-phosphoryloxy]-phenyl-1,2-dioxetane）Dioxetane中文名为：3-（2-

螺旋金刚烷）・4.甲氧基・4・（3•磷氧酰）・苯基-12二氧环乙烷。在碱性磷

酸酶（ALP）作用下，磷酸酯基发生水解而脱去一种磷酸基，得到一种

中档稳定中间体AMPD（半寿期为2-30min）,此中间体经分子内电

子转移裂解为一分子金刚烷酮和一分子处在激发态间氧苯甲酸甲酯

阴离子，当其回到基态时产生470nm光，可持续几十分钟（如图5）。

AMPPD为磷酸酯酶直接化学发光底物，可用来检测碱性磷酸酯酶或

酶和抗体、核酸探针及其他配基结合物。可检测到碱性磷酸酯酶浓度

为10・15mol/Lo

美国DPC公司Immulite全自动酶放大发光免疫分析仪，以碱性

磷酸酶为标记物，以金刚烷作发光底物，测定敏捷度相称于10-

21mol/mL酶，采用聚苯乙烯珠作载体，其检测水平已能达到10-

12g/mLo

AMPPD是一种生物化学领域中最新超敏捷碱性磷酸酶底物，其

特点：反映速度快，在很短时间内提供对的可靠成果。在它分子构造

中有两个重要某些，一种是联接苯环和金刚烷二氧四节环，它可以断

裂并发射光子；另一种是磷酸根基团，它维持着整个分子构造稳定。

在普通状况下，这种化合物很稳定。但是当有碱性磷酸酶存在时，

DioxetanePhosphate作为醐底物会在醐催化一脱去磷酸根基团，形成

一种不稳定中间体。这个中间体随后自行分解（二氧四节环断裂），

同步发射光子。

该试剂采用微粒子化学发光技术，采用最新磁性微粒，用以包被

抗体。用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原（抗体）。通过普通抗原抗体

反映，碱性磷酸酶结合在微粒子上，碱性磷酸酶结合量同病人血清中

待测物质成比例。通过洗涤（反映管两边有磁场，磁性微粒包被抗原

抗体结合物被吸附在管子两边，别的游离某些被抽吸掉），最后加入

发光底物DioxetanePhosphate,5分钟后，仪器通过光电倍增管检测

反映发光强度。

AMPPD是碱性磷酸酶化学发光底物，在适当缓冲液中，随着酶

催化水解作用，AMPPD分解成AMP・D,后者发出强度很高光信号,

其发光速度取决于碱磷酶浓度。当碱磷酶偶合到杂交探针时，便可以

通过此系统检测到杂交分子存在量。

2微粒体发光免疫分析

微粒体发光免疫分析（microparticleluminescenceenzyme

immunoassay,MLEIA），该免疫分析技术有两种办法：一种是小分子抗

原物质测定采用竞争法。另一种是大分子抗原物质测定采用双抗体夹

心法。该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0um,这样大

大增长了包被表面积，增长抗原或抗体吸附量，使反映速度加快，也

使清洗和分离更简便，从而减少污染，减少交叉污染概率。反映中使

用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原或抗体，作用于其底物二氧乙烷磷酸

酯，由其在激发态与基态动力学变化中发生发光反映。

2.1＞竞争反映

其原理是：用过量包被磁颗粒抗体，与待测抗原和定量标记口丫陡

酯抗原同步加入反映杯温育，其免疫反映结合形式有两种，一是标记

抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体结合形式。如受检标

本中具有待测抗原，则与标记抗原以同样机会与磁颗粒包被抗体结

合，竞争性地占去了我咤酯标记抗原与磁颗粒包被抗体结合机会，使

口丫咤酯标记抗原与磁颗粒包被抗体结合量减少。由于磁颗粒包被抗体

是过量，足以与待测抗原结合。

2.2、双抗体夹心法：

其原理是：标记抗体与被测抗原同步与包被抗体结合成一种反映

形式，即包被抗体■测定抗原•发光抗体复合物。详细讲是以顺磁性微

珠作为载体包被抗体，运用磁性微珠能被磁场吸引，在磁场作用下发

生力学移动特性，迅速捕获到被测抗原，当加入标本后，标本中抗原

与磁性抗体形成复合物，在磁力作用下，协助该复合物迅速地与其她

非特异性物质分离，使抗原■抗体结合反映时间缩短，测定期间减少,

减少了交叉污染几率，此时再加入碱性磷酸酶标记第二抗体，形成磁

珠包被抗体■抗原■酶标记抗体复合物，经洗涤去掉未结合抗体后，加

入ALP发光底物环1,2.二氧乙烷衍生物AMPPD。

AMPPD被复合物上ALP催化，迅速地去磷酸基团，生成不稳定

中间体AMPDoAMPD迅速分解，从高能激发态回到低能量稳定态

时，持续稳定地发射出光子（hv）,发射光所释放光子能量被光量子

阅读系统记录，通过计算机解决系统将光能量强度在原则曲线上转换

为待测抗原浓度，并报告成果。其检测水平可达pg/ml水平，重复性

好。

3、电化学发光免疫分析（Electrochemiluminescenceimmunoassay,

ECLIA）

ECLIA是继放射免疫、酗免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定

后来新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（ECL）和免疫测定相

结合产物。它标记物发光原理与普通化学发光（CLA）不同，是一

种在电极表面由电化学引起特异性化学发光反映，事实上涉及了电化

学和化学发光二个过程。ECL与CLA差别在于ECLA是电启动发光

反映，而CLA是通过化合物混合启动发光反映。ECLA不但可以应

用于所有免疫测定，并且还可用于DNA/RNA探针检测。

其检测原理（以TSH检测为例）：第一步：结合了活化三联此咤

钉衍生物即［Ru（bpy）3］2++N羟基琥珀酰胺酯（NHS）TSH抗体和结合

了生物素TSH抗体与待测血清同步加入一种反映杯中孵育9分钟。

第二步：将被链霉亲和素包被磁珠加入反映杯中，再次孵育9分

钟，使生物素通过与亲和素结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成

双抗体夹心法。

下一步，蠕动泵将形成［Ru（bpy）3p+■抗体.抗原.抗体.磁珠复合体

吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面磁铁吸附于电极表面。

同步，游离TSH抗体(与生物素结合和与［Ru(bpy)3］2+结合抗体)也

被吸出测量室。

紧接着，蠕动泵加入含三丙胺(TPA)缓冲液，同步电极加电压,

启动ECL反映过程。发光剂［Ru(bpy)3产和电子供体TPA在阳极表

面可同步各失去一种电子而发生氧化反映，使二价［Ru(bpy)3］2+被氧化

成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA被氧化成阳离子自

由基TPA+®,后者很不稳定，可自发失去一种质子(H+),形成自

由基TPA•，这是一种很强还原剂，可将一种电子给三价［Ru(bpy)3p+,

使其形成激发态［Ru(bpy)T+,而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。

激发态［Ru(bpy)3p+通过荧光机制衰减，发射出一种波长620nm光子,

重新生成基态［Ru(bpy)3p。该过程在电极表面周而复始地进行，产生

许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与［Ru(bpy)3］2+浓度呈线

性关系，故可测出待测抗原含量。

最后，终结电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备

下一种样品测定。

4、时间辨别荧光免疫分析(timeresolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)

TRFIA以锢系元素作为标记物所建立免疫测定技术。因锢系元素

(如Eu3+)所发射荧光寿命长，在测定特异性荧光时，可通过延迟检测

时间而将标本或环境中非特异荧光扣除，使其具备良好信噪比。

时间辨别荧光免疫测定(TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术,

它用锢系元素标记抗原或抗体，依照锢系元素螯合物发光特点，用时

间辨别技术测量荧光，同步检测波长和时间两个参数进行信号辨别，

可有效地排除非特异荧光干扰，极大地提高了分析敏捷度。

在生物流体和血清中许多复合物和蛋白自身就可以发荧光，因而

使用老式发色团进而进行荧光检测敏捷度就会严重下降。大某些背景

荧光信号是短时存在，因而将长衰减寿命标记物与时间辨别荧光技术

相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

时间辨别荧光分析法（TRFIA）事实上是在荧光分析（FIA）基

本上发展起来，它是一种特殊荧光分析。荧光分析运用了荧光波长与

其激发波长巨大差别克服了普通紫外•可见分光分析法中杂色光影

响，同步，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同始

终线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学

分析敏捷度。但是，当进行超微量分析时候，激发光杂散光影响就显

得严重了。因而，解决激发光杂散光影响成了提高敏捷度瓶颈。

解决杂散光影响最佳办法固然是测量时没有激发光存在。但普通

荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。但是有非常

少稀土金属（Eu、Tb、Sm>Dy）荧光寿命较长，可达l~2ms,可

以满足测量规定，因而而产生了时间辨别荧光分析法，虽然用长效荧

光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度分析办法医学教|育网收

集整顿。

平时惯用稀土金属重要是Eu（钻）和Tb（锹），Eu荧光寿命1ms,

在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms,水中

稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因而从测

量办法学上看Tb较好，但不合用于生物分析，故Eu最为惯用。

4.1、时间辨别信号原理

普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选取荧光物质作

为标记物时，必