2025版高考生物二轮复习课件 易错点12 双标记基因载体

双标记基因载体易

错点12[名师支招]1.双标记基因载体的作用

双标记基因载体具有两个标记性状，如四环素抗性和青霉素抗性，在基因表达载体的构建中会破坏其中一个，如破坏四环素抗性，含有目的基因的基因表达载体此时只有青霉素抗性，而空载体依然具有四环素抗性和青霉素抗性，通过在培养基中添加四环素，可以区分出含有目的基因的载体和空载体。2.双标记原理 (1)单标记的区分问题：仅有一个标记基因时，含有目的基因的载体和空载体都有标记，在筛选时无法区分。(2)双标记方法：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组载体的细菌和含空载体的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布将上述5个菌落影印到含有四环素的培养基上，如上图，能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。提醒①标记基因本身也是一个能正常表达的基因，具有自己的启动子和终止子。②受体细胞不同，标记基因种类也不同；受体细胞为细菌时，标记基因通常是抗生素抗性基因；受体细胞为真核细胞，尤其是动植物细胞时，抗生素很多时候不能杀死未标记的细胞，无法起到筛选的效果，此时标记基因通常选择荧光基因等。[典例赏析]1.(2024·山东青岛期末)研究人员将大麦细胞的LTP1基因导入酵母中，让酵母产生LTP1蛋白。下图为该实验过程的部分流程。下列说法正确的是(

)BA.运用PCR扩增LTP1基因时，应选择图1的A和D作为引物B.为方便构建重组质粒，可在引物5′端添加限制酶的识别序列C.筛选导入重组质粒的啤酒酵母时，只需配制含青霉素的培养基D.为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因两侧添加大麦的启动子和终止子解析

DNA复制子链延伸的方向只能从5′端到3′端，也就是DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，由图可知，构建前利用PCR技术扩增目的基因时，应选取B和C作为引物，A错误；为构建目的基因和质粒连接的重组质粒，往往需要在引物5′端适当增加限制酶识别序列方便切割，B正确；由图可知，构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，而青霉素抗性基因没有被破坏，因此将导入C的酵母菌分别在含有青霉素和四环素的两种选择培养基上培养，则在含有青霉素的培养基上能存活，但在含有四环素的培养基上不能存活的才是导入重组质粒的啤酒酵母，C错误；为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因上游添加酵母的启动子，下游添加酵母的终止子，D错误。2.(2024·江苏海安高级中学联考)荧光蛋白(GFP)在紫外光下会发出绿色荧光，某科研团队将GFP基因插入质粒P中构建了重组质粒载体P0，用于基因工程中基因表达载体(P1)的筛选和鉴定。部分过程如图所示，如表为部分限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题：(1)过程①中用EcoRⅤ酶切获得的目的基因具有________末端，过程②表示利用PCR技术扩增目的基因，前提是要根据________________________设计出引物。(2)过程③中，质粒P0需用限制酶________切割，与扩增出的目的基因在__________酶作用下形成P1。平目的基因的一段核苷酸序列BamHⅠDNA连接(3)为了筛选出含有质粒P1的菌落，需采用添加________的培养基进行培养，在紫外光下____________________的菌落，为含有P1的菌落。(4)提取经上述筛选所得菌落的RNA，通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出目的基因，可能的原因是___________________________。进行扩增时需先加热至90～95℃，加入引物后冷却至55～60℃，以上调控温度操作的目的分别是__________________、________________________。四环素不发出绿色荧光逆转录目的基因未能在受体菌中转录使DNA解聚为单链使引物与互补DNA链结合解析

(1)由表格可知，用EcoRⅤ酶切获得的目的基因具有平末端。过程②表示利用PCR技术扩增目的基因，需要根据目的基因的一段核苷酸序列设计出引物。(2)由图可知，构建P1时，限制酶Sau3AⅠ会破坏四环素抗性基因(标记基因)，而EcoRⅤ会破坏复制原点，可选择BamHⅠ切割，与扩增出的目的基因在DNA连接酶作用下形成P1。(3)为了筛选含有质粒P1的菌落，由于标记基因是四环素抗性基因，所以需采用添加了四环素的培养基进行培养，在紫外光下，由于BamHⅠ破坏了GFP基因，所以选择不发出绿色荧光的菌落，为含有P1的菌落。(4)所得菌落的RNA通过逆转录获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出目的基因，可能的原因是目的基因未能在受体菌中转录。当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，温度下降到50