2025版高考生物二轮复习课件 课时4 突破基因工程类大题

突破基因工程类大题课

时4考情速览热点考情RT－RCR、实时荧光定量、PCR与反向PCR①2022·全国乙卷，38；②2022·江苏卷，24；①2020·江苏卷，33；②2020·山东卷，25PCR定点诱变技术①2023·辽宁卷，25；①2021·天津卷，16热点考情单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测①2024·黑吉辽卷，17、25；②2024·全国甲卷，38；③2024·河北卷，24；④2024·湖南卷，15；⑤2024·江西卷，12；⑥2024·浙江6月选考，19、20；①2023·山东卷，25；①2022·福建卷，13目

录突破1基因工程的热考题型PCR定点突变技术突破2突破1

基因工程的热考题型题型一限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点选择限制酶①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点，如图乙)(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)[例1]

(2024·巴蜀中学适应考)科学家从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，进行克隆，复制了2400年前的DNA。某生物兴趣小组同学模拟了其中部分研究过程，设计了如下实验(MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ为4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG)。请回答以下问题：(1)从解旋过程进行分析，PCR扩增木乃伊基因与体内DNA复制过程不相同的地方是_______________________________________________________________________________________________________________________(答出两点)。(2)若将图乙中质粒和图甲中木乃伊基因通过同种限制酶处理后，构建重组质粒，应选用的限制酶是________，选择理由是__________________________________________________________________________________________________。 PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋BamHⅠ

用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后能保留完整的目的基因和标记基因(合理即可)(3)经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能正确表达，最可能的原因是__________________________________________________________。(4)据图丙分析，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A、B还应分别含有______________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是___________菌落中的细菌。同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接青霉素、四环素4和6解析

(1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋。(2)能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为G↓GATCC的BamHⅠ和识别序列为↓GATC的MboⅠ，若使用MboⅠ会同时破坏质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因，所以要用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的青霉素抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)因为目的基因和载体是用同种限制酶切割的，同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接，导致目的基因不能正确表达。(4)用限制酶BamHⅠ对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的大肠杆菌能在含有青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素的培养基上生存。所以图丙培养基A和培养基B还应分别含有青霉素、四环素。从检测筛选的结果分析，培养基A中含有菌落4和6，培养基B中不含菌落4和6，故含目的基因的是4和6菌落中的细菌。题型二PCR中引物的设计与选择利用PCR扩增目的基因(如干扰素基因)时，设计引物序列的主要依据是有一段已知目的基因(干扰素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(1)引物的作用：TaqDNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，TaqDNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。(2)设计引物应遵循的主要原则①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合。②引物与靶序列间的Tm(指当50%的引物和靶序列表现为双链DNA分子时的温度)不应过低。③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列。④2个引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列。⑤引物中碱基的分布应尽可能均匀，G＋C含量接近50%。(3)引物的处理由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。(4)PCR循环时与引物相关的计算PCR经过n次循环产生的DNA数为2n，一共有2n＋1条链，其中有2条链是DNA母链，不含引物，其他的每1条链均含1个引物，并且2种引物的数量相等，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2n＋1－2，需要某一种引物的总个数是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一个DNA由1条母链和第1种引物延伸的子链组成，另一个DNA由另1条母链和第2种引物延伸的子链组成，其他的DNA均由2种引物延伸的2条子链组成。[例2]

(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是_________________________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是____________________________________________________。水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离

溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA(2)本操作中获取目的基因的方法是______________和________。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是________________________________。PCR技术扩增人工合成RNA聚合酶识别并结合的部位提高目的基因的转录效率(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。HygBRF3R2(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达C.将1～1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列D.用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白D解析

(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成法和PCR技术扩增法。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因的转录效率。(4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。(6)D项所述内容制造了新的蛋白质，属于蛋白质工程。突破2

PCR定点突变技术题型一重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：题型二大引物PCR技术大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。题型三反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。[例1]

(2024·广东惠州调研)重叠延伸PCR技术是设计含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物，在PCR过程中，互补的核苷酸片段形成重叠，重叠的部分互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得突变基因的方法。科学家将枯草芽孢杆菌基因组上的甘油激酶编码基因glpk的第270位氨基酸M突变为I，构建出了对甘油的利用水平大大提升的枯草芽孢杆菌，其原理如图。请回答下列问题：(1)含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的________。通过PCR1获得产物AB需要进行________次的PCR扩增。(2)本实验获得点突变的目的基因两端为平末端，为便于构建基因表达载体，需要将限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变甘油激酶编码基因的两端，操作思路是____________________________________________________________________________________________________________。b和c3/三

将带有BamHⅠ和SalⅠ的识别序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4DNA连接酶将其与突变产物的两端相连接(3)获取目的基因后，构建质粒载体，形成基因表达载体。基因表达载体上保证其能在宿主细胞中扩增的结构是________，保证目的基因能正常转录的结构是______________________________。(4)对甘油激酶的改造属于________工程的应用，其第一步是____________________。复制原点启动子和终止子蛋白质预期蛋白质的功能解析

(1)根据题图可知，含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的b和c；PCR过程是核苷酸链从5′端向3′端的延伸过程，从目标DNA链中PCR出产物AB需要进行3次PCR循环(第一次循环扩增出来的新片段很长很长；第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因；第三次循环，当以第二次循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三次循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因了)。(2)将带有BamHⅠ和SalⅠ的识别序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4DNA连接酶将其与突变产物的两端相连接，可将限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变甘油激酶编码基因的两端。(3)获取目的基因后，可将其与质粒重组。基因表达载体上保证其能在宿主细胞中扩增的结构是复制原点，保证目的基因能正常转录的结构是启动子(RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质)和终止子(位于基因的下游，也是一段特殊的DNA片段，功能：终止mRNA的转录)。(4)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，结合题意对甘油激酶的改造属于蛋白质工程的应用，其第一步是预期蛋白质的功能。[例2]

(2024·南通一模)重叠延伸PCR定点突变过程分为两步，如图1。内皮抑素能通过抑制血管内皮细胞的增殖和血管的生成限制肿瘤细胞的生长。研究人员利用重叠延伸PCR定点突变技术将内皮抑素基因endo改造为能进入癌细胞并有较强抑癌作用的突变基因endo(m)，并再与抗Her2(人表皮生长因子受体2)的纳米抗体基因Dim形成融合基因Dim－endo(m)，导入大肠杆菌并表达，主要过程如图2，其中KanR表示卡那霉素抗性基因，调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合抑制基因的表达，IPTG能与LacI的表达产物结合，诱导目的基因的表达。请回答下列问题。(1)图1中PCR1和PCR2配制反应体系时需加入不同的________。图2中构建重组质粒时使用的限制酶是________________。引物EcoRⅠ、HindⅢ(2)下列①～⑥是相关引物，其中突变1F为引物①，则突变1R、突变2F、突变2R分别为________、________、________。①5′－GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC－3′②5′－CCGGAATTCCATATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC－3′③5′－GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC－3′④5′－GTGGCATGGCTCGGACGCAAACGGGCGCAGGCTG－3′⑤5′－ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG－3′⑥5′－CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCGAGCCATGCCAC－3′③④⑥(3)导入重组质粒的大肠杆菌由于调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合，阻止________________酶的移动，抑制Dim－endo(m)的转录。当菌株扩大培养到一定数量后在培养基中加入________________，使Dim－endo(m)持续表达。RNA聚合IPTG(4)研究表明，乳腺癌常出现Her2基因的高表达(不同乳腺癌细胞的表达有差异)，因此Her2被认为是乳腺癌检测和治疗的重要靶点。研究人员用不同浓度Dim－endo(m)融合蛋白处理乳腺癌细胞SKBR3、MDA231、MCF7和正常乳腺细胞HBL100作为实验组，选取正常培养的乳腺癌细胞和正常乳腺细胞作为对照组，一段时间后分别测定对照组和实验组的细胞数并计算抑制率，结果如图所示，抑制率的计算公式是_____________________________________。Dim－endo(m)融合蛋白对不同乳腺癌细胞的抑制率不同，其可能原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(1－实验组细胞数/对照组细胞数)×100%

不同乳腺癌细胞Her2基因的表达水平不同，进入癌细胞的Dim－endo(m)融合蛋白的数量有差异；[Dim－endo(m)融合蛋白中的endo(m)对不同乳腺癌细胞的杀伤力不同](5)纳米抗体是传统抗体的重链可变区片段，只有传统抗体的1/10，但内部存在更多的二硫键，结构更稳定。与传统抗体相比，纳米抗体的优点是___________________________________________________________________。穿透力强，作用持久，免疫原性弱解析(1)DNA聚合酶要延伸DNA链，