单味中药对子宫肌瘤之实验研究

单味中药对子宫肌瘤之实验研究

【关键词】

吴茱萸

【摘要】

目的

观察单味中药对子宫肌瘤之影响。方法

应用terazolium(MTT)反应法,针对传统中药以50%乙醇之萃取物进行子宫肌瘤细胞生长抑制试验。结果

发现20种单味中药(吴茱萸,王不留行,水蛭等)对子宫肌瘤细胞抑制率较正常子宫细胞明显增高。结论

子宫肌瘤细胞半致死量浓度(IC50)之测定,较正常子宫细胞为低,显示这些中药对子宫肌瘤细胞较为敏感,应可经由细胞凋亡的途径,而抑制子宫肌瘤细胞生长。

【关键词】

王不留行；吴茱萸；水蛭；生黄芪；子宫肌瘤细胞；细胞凋亡

EffectsofChineseherbonmyoma

【Abstract】

ByobserveinourthaditionalChineseHerbscureMyomaoftheuterusrepressgrowing

Useoftetrazolium(MTT)inourtraditionalChinese50%alcoholnaturalproductsrepreessgrowingtestthoseherbsaremoreeffectiveinrepressMyoma

Wefound20kindsofChineseHerbs(EvodiaeFeuctur,VaccariaeSemen,Hirudo，etc),thoseherbsaremoreeffectiveinrepressMyomacellthannormalMyoma

WeconcludethatDi-DargTangandVaccariaseediswelltolerated,safe,andeffective;ThetestshowsthatthoseherbsaremoresensitiveonMyomacell,Bcl-2proteincanrepressMyomacellbyapoptosis.

【Keywords】

vaccariaesemen;evodiaefeuctus;hirudo;astragaliradix;myomacell;apoptosis

子宫肌瘤是妇科最常见的良性肿瘤,由平滑肌纤维和结缔组织组成,所以临床上又称子宫纤维瘤。子宫肌瘤好发于20～50岁的妇女,其中年龄＞40岁的妇女约有50%患有子宫肌瘤,但Cramer和Patel经尸体解剖(autopsy)的统计后认为子宫肌瘤的发生率高达75%［1］。

对于一个不需再生育的妇女而言,全子宫切除(totalhystectomy)是治疗子宫肌瘤的方法之一,然而台湾地区子宫切除术是否有过于泛滥的情形常受质疑。有研究指出台湾地区子宫切除率以台北、台中、高雄为高。变异大多可由医疗资源分布解释,而子宫切除年龄最高分布在40～44岁占%。除癌细胞病变外,以生殖器脱垂的病变为最高,这可以由医疗不适当性解释［2］。因而子宫切除的适当性除须由专家审视外,如果能有更多其他替代疗法,也是对妇女的一种保障。

子宫肌瘤真正形成的原因,至今尚不清楚,但有不少研究认为雌激素(estrogen)与黄体素(progesterone)与子宫肌瘤的生长有密切关系,这些激素又必须透过生长因子(growthfactor)才能运作［3］，而人绒毛膜促性腺激素(human，HCG)也能调节生长。黄体素可刺激子宫肌瘤上皮生长因子(epidermalgrowhfactor)产生，造成子宫肌瘤的增生和分化。子宫肌瘤虽然是由单一的细胞突变开始,而雌激素可增加雌激素接受体(estrogenreceptor,ER)与黄体素受体(progsteronereceptor,PR)也可促进子宫肌瘤的增生。黄体素则对突变的正常子宫细胞有加速分裂和增生的作用［4］。

性腺激素释放激素强化物(GnRHa)是经由降低GnRH接受体而使性腺分泌减少,进而使卵巢分泌雌激素和黄体素减少,而抑制子宫肌瘤生长［5］。根据国内研究,GnRHa在连续注射到12周时,达到最大的疗效,大部分的子宫肌瘤会缩小为原来的一半。缩小的百分比和未结合PR浓度成反比,而和未结合ER关系不大。因此GnRHa可缩小子宫肌瘤,部分取决于子宫肌瘤上未结合性激素接受体浓度所影响［6］。

子宫肌瘤属于中医医学“积聚”“瘕”范围,瘕是泛指腹腔内的有形肿块而言,所谓者,是指腹腔内有形的肿块,有一定的部位,属血病。所谓瘕者,是指腹腔内无形的气块,无一定的部位,属气病。《内经・灵枢・水胀篇》谓;“石瘕生于胞中,寒气客于子门,子门闭塞,气不得通,恶血当泻不泻,以留止,日益以大,状如怀子,月事不以时下,皆生于女子,可导而下”。《校注妇人良方》谓“妇人腹中瘀者,由月经闭积,或产后血未尽,或风寒滞瘀,久而不消,则为积聚瘕矣”。因此中医认为,六淫之邪,七情内伤,引起脏腑功能失调,气血不合,以致气滞血瘀,新血与旧血凝聚成块,结于胞室,日益长大而成子宫肌瘤。

子宫肌瘤临床表现为月经过多,经期延长,周期缩短,或不规则子宫出血,常会伴有不同程度的贫血。中医认为,脏腑不合,气滞血瘀,冲任失调是本病的主要原因,临床上可以辨证分型治疗。本病是以子宫出血为主要临床症状,病久失血,而导致气血两虚,在治疗时,除出血期以化瘀止血、平时破瘀消外,还必须结合补益气血。对于瘕的治法,《内经》提出“坚者削之,结者散之,留者攻之,滞者导之”的原则;《女科经纶》：“善治瘕者,调其气而破其血,消其食而豁其痰,衰其大半而止”。

汉方医学已有数千年之历史,而且是累积经验的循证疗法之一,由于化学药物引起的药害,以及食品添加物或清洁剂引起的公害等,引起人们对利用自然药物的兴趣,纷纷把目光转向天然中药。依据汉方的思想,绝大多数的妇女疾病是属于体内“血”的异常,中医所谓的“血”,不单是指血液,也包括淋巴液或激素作用。中医对女性的生理及病理独具慧眼,其用药经验可以说是数千年来累积而成。

中药的运用是几千年来前人智慧结晶所在,其内容相当丰富且千变万化。从《内经》、《伤寒论》始,前人从药物的升降浮沉,四气五味,虚实补泻,脏腑归经,针对人体阴阳表里,寒热虚实,把数百种药物归纳,依据理论用于临床。

本研究已建立细胞模式,以期能从天然产物中找出明确具有治疗子宫肌瘤之中药,为医师临床用药提供参考,造福更多的妇女。

1

实验材料

中药材来源

本项研究所测试的中药材来自台北南京泰生堂参药有限公司,实验中药材见表1。

表1

单味药材50%酒精之萃取率略

仪器

(1)回转式真空减压浓缩机(SwitzerlandBUCHIRE111);(2)离心机Centrifuge5415C(Eppendorf);(3)冷冻干燥机(Eyela;Cool);(4)微量电子天秤(Shimazu,LibrorACF-200)；(5)显微镜(Olympus,Tokyo)；(6)二氧化碳培养箱(EspecBNA-211)；(7)血细胞计数器(Hemocytometer;Bright-line)；(8)组织培养角瓶(Corning)；(9)组织培养皿(Falcon)；(10)96-Well组织培养盘(Corning)；(11)微量吸管(Biohit)；(12)高温灭菌器(Tomin1MedicalEquipmeneCo,LTD;TM-325)；(13)过滤膜(Coming)；(14)-80℃冰箱(EnviromentalEquip.Co;So-Low)。

子宫肌瘤细胞

由荣民医院妇产科提供病理检体。当患者在妇产科门诊,以内诊与超声波扫描确诊为子宫肌瘤,依临床路径安排入院手术治病者,以做本研究之素材。即由此类患者在手术切除后,立即切取肌瘤组织,放入转输液(DMEM)中,送实验室做组织培养。

试药与试剂

培养液

（1）DMEM(Dulbecco’sMinimumEssentialMedium)；（2）FetalBovineSerum(Hyclone:Cat)；（3）Penicillin-Strepetomycin(Seromed:CatNo.03-033-1B)；（4）L-Glutamine(Seromed:Cat)；（5）NAA(Mem-EagleNon-essentialAminoAcidsSolution)；（6）L-Glutamine200mM(Gibco:CatNo.25930-081)。

染色剂

（1）Trypanblue(Sigma)；（2）MTT:{3(4,5-dimethylthiazoled1-2-y1)-2,5-dipheyltetrasoliumbromide}(BoehringerMannheimGmbKCatNo.1465007)。

一般化学药品

（1）DMSO(Merck,Germany,K251931,Max%H2O)；（2）SodiumHydrogenCarbonate(Merck,Germany,NaHCO3;Proanalysis)；（3）Isopropanol(Merck,Germany)。

测试药品与酵素

（1）B-Estradiol(SigmaUSA)E-2758Lot79H0941；（2）Progesteronl(SigmaUSA)P-8783Lot80K0885；（3）Trypsin,%(SigmaUSA)Lot1077108；（4）Trypsin-EDTA(SigmaUSA)Lot1089908；（5）LSAB(Dako,Denmark,CodeNo.K0675)；（6）MonoclonalAnti-HumanProgesteronereceptors(Dako,Denmark,clonepgR636,1:50)。

2

实验方法

单味药之制备

将单味药经粉碎后,加十倍重量之50%酒精,60℃水浴回流抽取2h,趁热过滤。同法两次后合并滤液经减压浓缩制约1/10体积量。经冷冻干燥得粉末状浓缩物,其产率见表1所示,将冷冻粉末置于20℃冰柜中以备下列实验使用。

一般溶液之配制

PBS(phosphatebuffersolution)之配制

将KCl，NaCl，NaH2PO4・及KH2PO4溶于次蒸馏500ml中,高压减菌后使用。

MTT配制方法

称取MTT5mg溶于10ml成浓度500μm,制完全溶解后以μm之过滤膜过滤。

检测药物之制备

实验前将冷冻干燥之各种药品精称10mg,以1mlDMSO溶解,再用研钵细磨后,以μmmicrofilterunit过滤,分别调制成浓度为10mg/ml之stocksolution。每次检测时,加入2μlstocksolution于每孔含198μl培养液中,使最后单位药之浓度100μg/ml。

试验细胞之制备

子宫肌瘤和正常子宫组织

从荣民医院手术室取出后,置于含DMEM的试管中,以冰块冷冻带回实验室,于1h内切碎进行组织培养。

子宫肌瘤和正常子宫组织

将其分别切成1mm之小块,加入/mlcollagenasetypeⅡ和%trypsin各3ml,于37℃。4h后呈黏稠状,用胶吸管打散细胞(pipetting),经离心(1200r,4℃,5min)去上清液。加入DMEM,再离心后去上清液。加入5mlDMEM均匀分布于培养皿,2天换一次培养液,于5%CO237℃培养7～14天。待细胞生长形成单层细胞(monolayer)细胞数约1×106cells/ml既可使用。

试验细胞之染色

将初代培养的子宫肌瘤细胞和正常细胞,培养于培养皿中,利用免疫组织化学方法,经染色、照相后,作为试验细胞鉴别区分之用。组织培养之新鲜标本于培养基中,以PBS溶液清洗,再以%过氧化氢溶液浸泡30min,经PBS溶液清洗10min,接着进行免疫化学染色,所使用的单株抗体为抗人类黄体素接受抗体(monoclonalanti-humanprogesteronereceptorsantibody)。以适当浓度之单株抗体与培养细胞作用约1h,经PBS溶液洗10min后,以经生物素标示之二次抗体(biotinylatedsecon

daryantibodies)作用30min,在经PBS溶液清洗10min后,以经具有过氧化酶之卵蛋白作用30min,经PBS溶液清洗10min后,以呈色剂(DAB,3,3-diaminobenzidine)呈色5min,以PBS溶液清洗,以苏木精做对比染色,之后置于镜下观察照相［7～9］

Bcl-2蛋白之制备

利用%trypsin将细胞处理成悬浮液后,将细胞稀释成2×106cells/ml。各取出1ml植入6孔培养盘中,使每孔约含2×106个细胞,放入5%CO2培养箱中37℃培养。次日,细胞生长形成单层细胞(monolayer)后,倒掉培养液,更换新鲜培养液后备用。同时各孔加入estradiol或progesterone(stocksolution浓度各为10μg/ml、100μg/ml)(13)1μl后24h,再加入中药(stocksolution浓度为10mg/ml)10μl使浓度成为100μg/ml。24h后冲下细胞,离心(120XXr）20min去上清液后加RIPA30μl备用。第一组Estradiol(10ng/ml)；第二组Estradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三组Estradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四组Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五组Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六组对照组。

Westernblot分析法［10，11］

利用BioquantProtein(200μl)将细胞萃取物定量,按比例取出加入proteindye

3μl。将Totalproteinloading至10%SDS-PSGE后,以80V电泳3h,利用电转印槽(Electrotransfertank)以270mA1h,将蛋白质面SDS转至PVGEmembrane后,加入Blockingsolution(1%BovineserumBSA)1h,分别加入Bcl-2rabbitpolyclonalIgG,α-tubulinmousemonoclonalIgM(1∶1000)4℃置1夜,再以PBST清洗,分别加入anti-rabbitIgG和anti-mouseIgG(1∶5000)1h后,再以PBST清洗后加呈色剂至呈色为止,再以清水洗去呈色剂后晒干。

半致死量浓度(Theconcentrationof50%inhibition,IC50）之测定

实验前将冷冻干燥之各种药品分别经称2、4、6、8、10、12、14、16mg以DMSO1ml溶解,再用研钵细磨后,以μlmicrofilterunit过滤,分别调至成不同浓度之stocksolution。每well加入stocksolution2μl于含198μl培养基中,使最后中药浓度为40、80、120、160、200、240、280、320mg/ml。第二天观察细胞生长情形,进行Tetrazolium反应法(MTTassay,计算其IC50）。

细胞毒杀百分率之计算公式

CI%=1-(实验组之OD值/对照组之OD值）×100%。

统计学方法

各药物之抑制率分别以平均标准偏差(Mean±SD)表示之,统计皆用student’st-test方法计算。

3

实验结果

单味药对子宫肌瘤细胞和正常细胞毒性百分比(CytotxicityIndex)之比较;在20种单味药中，王不留行、吴茱萸、生鸡内金、水蛭(100μg/ml)对子宫肌瘤的细胞毒性百分比(CytotoxityIndex)较正常细胞高很多,见表2～4、图1。

图1

中药对子宫肌瘤细胞毒性百分比

表2

单味药对正常细胞和子宫肌瘤细胞的细胞毒性百分比

（略）

表3

王不留行对不同浓度子宫肌瘤细胞毒性百分比

（略）

表4

王不留行对子宫肌瘤细胞之IC50略

半致死量浓度在不同细胞之测定结果,王不留行汲水置在子宫肌瘤细胞的浓度,都小于正常细胞的浓度,显示子宫肌瘤细胞对于这些中药较为敏感,也较正常细胞有效。

Bcl-2蛋白质Westernblot分析法结果：正常子宫细胞和子宫肌瘤细胞在Estradiol(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2的变化。Myometriumcell和Myomacell的第二组比第三组颜色较淡,第五组比第四组颜色较淡,显示Bcl-2较少。子宫肌瘤中Bcl-2protein受Progesterone(100ng/ml)刺激而增加,受Estradiol(10ng/ml)刺激而减少,因此第四组颜色要比第三组深,Bcl-2显示溶媒对实验结果影响不大,正常子宫细胞和子宫肌瘤细胞各有六组;第一组Etradiol(10ng/ml)；第二组Etradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三组Etradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四组Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五组Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六组对照组。

子宫肌瘤细胞加入王不留行的Bcl-2测定：正常子宫细胞和子宫肌瘤细胞在Estradio(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2蛋白质的变化Myometrium和Myomacell的Westenblot第二组。第五组色较淡,显示Bcl-2较少。

4

讨论

在本实验中单味药三菱、莪术、生鸡内金、水蛭对子宫肌瘤的细胞毒性百分比反而比正常细胞较低。三菱、莪术辛苦,性平和,入肝、脾二经能入血分以破血瘀,又能走气分以气消积,可抑制血小板聚集及血栓形成,也可扩张血管改善微循环。生鸡内金、水蛭主术恶血、瘀血、月闭,破血瘕积聚。生鸡内金不仅能加强消积化瘀之功效,亦顾护脾胃,亦可以散血去瘀、消肿定痛,水蛭会产生类似前列腺环素(prostacyclin,PGI2)可抑制血小板凝集、降低血压并释放出胞浆素原(plaminogen)［12］。

王不留行有催乳通经、消肿

止痛的功能,临床上用于乳痛、睾丸炎、流行性腮腺炎。其禁忌走而不守,血证慎用,孕妇忌用。其所含王不留行皂苷(Vacsegoside),经酸水解可生成王不留行次皂苷(Vaccaroside)及黄酮类(Saponaretin)、棉子糖(Raffinose)、香豆素、蛋白质等。在药理作用上具有抗早孕作用,可增加血浆和子宫组织cAMP,有抗感染作用可抑制前列腺增生,具有类似雌激素功用,对切除卵巢之白鼠可产生作用［13～15］。

细胞凋亡(apoptosis)在除去功能不良的细胞上扮演重要角色,而Bcl-2protein可经由一些growthfactor改变合成速率,进而抑制细胞凋亡［16～18］。Bcl-2protein是一种抑制细胞凋亡基因产物,在子宫肌瘤中正常细胞为多。子宫肌瘤中Bcl-2protein受Progesterone(100ng/ml)刺激而增加,受estradiol(10ng/ml)刺激而减少,但在本实验中,其增加或减少的程度并不如王不留行减少的程度来的明显。经由细胞凋亡而杀死肌瘤细胞,比传统药物所引发的细胞坏死(necrosis),较不易引发大范围的周边组织发炎或感染反应,避免对于患者产生更大地伤害［18］。

5

结论

药理实验和临床效果可能会有些差异,可能是由于药物在体内吸收、代谢加上相加、相克效应而有不同的反应,因此要发展改进实验模式,使其更加接近中医辨证的实际状。

经由细胞毒性抑制率实验结果得知,单味药中以吴茱萸、王不留行、生鸡内金和水蛭效果最好。由半致死量浓度IC50在不同细胞之测定结果,更可得知这些中药对于子宫肌瘤细胞较为有效。

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