免疫金技术课件

免疫金标记技术第五组免疫金技术主要内容一、免疫金技术的原理二、什么是胶体金三、胶体金的特点四、胶体金的制备五、胶体金的标记六、胶体金的应用七、胶体金在电镜水平的应用免疫金技术一、免疫金技术的原理免疫金技术是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术。本质：蛋白质等高分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。免疫金技术主要是利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法，这一反应也可通过银颗粒的沉积放大，成为免疫金银染色。免疫金技术二、什么是胶体金胶体金是氯金酸在还原剂如：白磷、抗坏血酸、柠檬酸钠和鞣酸等作用下，聚集成特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定胶体状态的水溶胶，具有高电子密度，在碱性环境中带负电，能与蛋白质分子的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成，紧连在金属表面的是内层负离子，外层离子层则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬浮状态。免疫金技术三、胶体金特点胶体金是一种带负电荷的疏水胶体溶液，在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平滑，完整，界线清楚，因而有确定性。另一方面，胶体金的颗粒表面带较多电荷，能对蛋白质等高分子物质进行吸附结合，得到胶体金蛋白，在免疫化学或组织学中，吸附在胶体金表面的抗原或抗体能定向将胶体金颗粒载运到组织或细胞内的相应抗原位置或固相载体上抗原、抗体的相应位置，由于金颗粒具高电子密度的特性，且这些标记物在固相载体上抗原抗体反应处聚集达到一定密度时（10^7/mm)，出现肉眼可见的粉红色斑点。所以其即可用于免疫电镜、光镜的抗原定位、定量和定性研究，也可作为指示物，用于体外免疫层析分析中检测抗原或抗体存在。免疫金技术四、胶体金的制备根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。①白磷还原法②抗坏血酸还原法③柠檬酸三钠还原法④硼氢化钠还原法⑤鞣酸-柠檬酸钠还原法(参考书上第146-147页）免疫金技术五、胶体金标记

1、概念抗原、抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金表面的包被过程，称胶体金标记。

2、标记吸附机理胶体金表面带负电荷，在适宜的PH条件下，与蛋白质分子的正电荷之间靠静电吸引力相互吸引，达到范德华引力范围内，即形成牢固的结合。如果胶体金的PH低于蛋白质等电点时，则会聚集失去结合能力。此外受胶体金的颗粒大小、离子浓度、蛋白质及其相对分子质量等因素影响。免疫金技术3、操作步骤如下：①待标记蛋白质预先以0.005mol/L(PH7.0)4℃透析过夜，除去盐离子。②取出透析蛋白溶液，4℃10000g/min离心1h，取上清液，弃沉淀，去除聚合物。③用0.2mol/Lk2co3或0.1mol/LHCl调节胶体金的PH④根据待标记蛋白质的要求，调节胶体金溶液的PH后，分装10管，每管1mL。⑤将待标记蛋白用PH9.0、0.005mol/L硼酸盐缓冲液做系列稀释为5~50ug/Ml,分别取1mL加入1管金溶胶液内。混合均匀。免疫金技术⑥放置5min后，在上述各管内加入0.1mL10﹪NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。（加入蛋白质量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变，其中含蛋白质量最低的试管即含稳定1mL胶体金所需的蛋白质量。在此基础上在增加10﹪~20﹪，即为待标记蛋白的实际用量。）⑦抗体蛋白的标记，按上述方法确定两种试剂的最适用量比例后，分别取所需用量的胶体金和相应抗体蛋白，用0.1mol/L,k2CO3调至PH9.0.在搅拌下将胶体金和抗体蛋白混合，10min后加入一定量的稳定剂(5﹪BSA)使其终浓度为1﹪至标记物总量的1/10,以防止抗体蛋白和胶体金的聚合和发生沉淀。免疫金技术胶体金制备的注意事项（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45μm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。免疫金技术六、胶体金的应用1、胶体金可用于标记许多生物大分子，如：免疫球蛋白、卵白素、植物血凝素、脂蛋白、糖蛋白等。2、用胶体金可制备不同的免疫金探针。3、胶体金主要在电镜水平的应用。4、胶体金在光镜水平的应用。5、凝集实验6、免疫印迹技术免疫金技术七、胶体金在电镜水平的应用1、胶体金在电镜水平的研究最早，应用最泛，其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为3~15nm胶体金均可用作电镜水平的标记物。3~15nm的胶体金多用于单一抗原的检测，而直径15nm多用于检测量较多的感染细胞。2、胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养