生乳及巴氏杀菌乳中嗜冷菌的测定快速培养法编制说明

《生乳及巴氏杀菌乳中嗜冷菌的测定快速培养法》一、工作简况2022年10月，XXXX完成了《生乳及巴氏杀菌乳中嗜冷菌的测定快速培养法》标准草案和项目建议书等书面材料，向全国畜牧业标准化技术委员会提出申报。2023年3月，农业农村部以《农业农村部农产品质量安全监管司关于下达2023年农业国家标准和行业标准制修订项目计划的通知》（农质标函〔2023〕51号）批准项目立项，项目计划编号：农质标函〔2023〕51号NYB-23049，标准起牛奶被称为“白色血液”，含有乳铁蛋白、维生素、氨基酸、脂肪酸、钙等多种易被人体吸收的物质，具有良好的营养价值，同时也成为适宜微生物生长的优良培养基。为了控制微生物污染，热加工处理和低温储存技术被广泛应用。但随着低温储存和冷链技术在嗜冷微生物通常被定义为最适生长温度在15℃左右，最高生长温度低于20℃,最低生长温度为0℃左右的微生物，广泛分布于土壤、水、空气中等。大量研究表明，生乳中最常见的嗜冷微生物是（Stenotrophomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和乳球菌属（Lactococcus）等。在低温环境下，嗜冷菌通过调节细胞膜的流动性、产生抗冻蛋白、冷休克蛋白、冷活性酶等4种途径，保持自身在低温下的活性，引起乳及乳制品在低温下的腐败现象。嗜冷芽孢杆菌（Bacillus）还有可能在生乳中形成孢子，在巴氏杀菌或超高温等热处理后存活，在萌发后形成营养细胞，且可能产生对人体有害的毒素。研究发现，乳中存在由嗜冷菌产生的低温下具有活性的蛋白酶和脂肪酶，并且这种酶即使经过热处理后仍保持部分活性，在乳及乳制品贮藏过程中分解蛋白质和脂肪，导致产生沉淀、异味、平板培养法是确定微生物计数的“金标准”方法。国际标准化组织（InternationalOrganizationforStandardization，ISO）颁布修订标准ISO17410《食品链微生物学嗜冷微生物计数的平行方法》，其2019版将之前使用的6.5℃需氧培养10d（平板倾注）修改为快速方法，用于预估生乳和巴氏杀菌乳中嗜冷微生物数量。与我国农业行业标准NY/T1331—2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢相比，快速方法仅需要25h，极大的缩短了培养时间。为对ISO17410:2019进行引用，本标准对ISO17410:2019中提出的嗜冷微生物培养方法进行了验证，为降低由嗜冷微生物造成的乳及乳制品腐（三）起草过程在接到标准制定任务后，2023年3月成立了标准起草组，包括表1标准起草组成员及分工序号姓名单位分工1XXXXXXX整体方案设计，组织协调2XXXXXXX标准征求意见、方法验证3XXXXXXX方法优化、材料完善4XXXXXXX方法优化、标准文本撰写5XXXXXXX方法验证、材料完善6XXXXXXX方法验证、材料完善7XXXXXXX材料检查修改8XXXXXXX材料检查修改9XXXXXXX材料检查修改ISO17410:2019Microbiologyofthefoodchain—HorizontalmethodfortheenumerationofpsychrotrophicmicroorganismsNY/T1331—2007乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧SN/T2552.4—2010乳及乳制品卫生微生物学检验方法第4部PsychrotrophicBacteriainRawandPasteurizedMilk.JMilkFood王克新,房玉国,张丽宏.液体乳中嗜冷菌数的测定.中国乳品工吉玲.生鲜乳中嗜冷菌检验的两种培养条件比较.中国乳品工业,2020,48:55-57.由于本文件涉及的内容在国际组织已经具有成熟的研究基础，考虑到我国奶业发展现状以及与国际组织有效接轨，标准起草组首先查阅了以上相关参考文献，认为ISO17410:2019Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofpsychrotrophicmicroorganisms中附录B内容对起草本标准具有引用价值。thefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofpsychrotrophicmicroorganisms2023年7月—2024年5月，标准起草组依据《食品安全国家标2024年6月，委托新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、唐山市农产品质量安全检验检测中心、农业农村部乳品质量检验测试中心（北京）等三家检测机构对方法的检测准确度进行复s）形成标准征求意见稿在以上收集和分析相关参考文献，调研、试验验证工作的基础上，起草组按照GB/T1.1—2020《标准化工化文件的结构和起草规则》和GB/T1.2—2020《标准化工作导则第定起草编写标准文本内容和编制说明内容，并组织开展5次专家讨2024年5月25日，XXXX召开讨论会，会议邀请了中国绿色食品发展中心、河南省农业农村厅、中国农业大学、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、山西农业大学、河北省现代农业产业技术体2024年8月17日，XXXX组织内部讨论会，XXX、XXX、2024年8月24日，XXXX组织召开线下会议，中国绿色食品发展中心、兰州大学、中国农业大学、北京农学院动物科学技术学院、农业农村部农产品质量安全中心、中国农业科学院、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所等单位相关专家对文本和编制说明进行2024年7月，在全国范围内遴选了20个科研院校、技术推广检测技术等领域单位及专家、有针对性地进行标准定向征求意见。征表2征求意见单位名单序号单位名称备注1/2/3/4/5/6/7/8/9////////////表3不同领域单位类型情况序号单位类型单位数量1教学机构32科研机构43技术推广机构4生产企业3收到20家单位及专家回函，回函20家，共有64条意见。经过研究和甄别，采纳37条意见，不采纳20条意见，部分采纳7条意见，并经过对征求意见稿进行修改完善，形成标准2024年11月21日，标准起草组组织召开了标准预郑小平、郑百芹、李俊玲、许文涛、单吉浩、牟玉莲、许晓敏7位专家，对标准预审稿进行了认真审查。在听取标准起草组汇报的基一是建议将标准名称修改为“生乳及巴氏杀菌乳中嗜冷菌的测定快速培养法”；二是删除术语和定义；三是编制说明中补充6.5℃和范标准文本。专家组一致同意审查通过，建议标准起草组按照上述意见进一步修改后形成《生乳及巴氏杀菌乳中嗜冷菌的测定快速培养法》（公开征求意见稿），报全国畜牧业标准化技术委员会秘书二、标准编制原则、主要内容及其确定依据（一）标准编制原则益。因此，在制定过程中严格贯彻国家有关方针、政策、法规和规（2）先进性：对本文件中有关内容的确定，力求反映本研究领域的国内外先进技术和经验，使标准中所规定的技术内容有利于乳（3）规范性：在本文件征求意见稿的编制过程中力求做到技术内容的叙述正确无误，文字表达准确和简明易懂，标准的构成严谨（4）可操作性：可操作性是制定标准的必备因素，因此，在制定标准的过程中，始终把经济实用和可操作性作为重要的依据，以2023年6月至2024年8月，标准起草组采集了我国北京、浙江、宁夏、福建、新疆等地乳品加工厂的奶罐车采集生牛乳共85份，陕西乳品加工厂的奶罐车采集生山羊乳样品14个，甘肃采集生绵羊乳样品30个，新疆采集生驴乳和生骆驼乳各11个，西藏采集生牦牛乳8个，冷藏条件下带回实验室，于12h内完成试验。巴氏杀菌乳共16份，10份购自北京的超市，6份为本实验室储藏样品，于12h内完成试验。用于制备人工污染样品的UHT乳购自北京的超市，在保质期乳平板计数琼脂（milkplatecountagar，MPC北京陆桥；相对正确度是参考方法的结果与待确认方法的结果之间的比较对所采集的生牛乳样品用两种条件进行培养后分别计数，计算嗜冷微生物浓度，以对数值表示，其中两种方法的差值用d表示。结果显示，21℃培养与6.5℃培养结果不完全一致，但Bland-Altman方法分析表明21℃培养结果可用于预估生乳和巴氏杀菌乳中嗜冷菌数表4生乳样品嗜冷微生物计数样品6.5℃21℃d样品6.5℃21℃d样品6.5℃21℃d13.463.180.28303.643.150.50594.843.7723.153.04310.00605.083.9134.043.260.78324.082.85614.813.830.9943.913.320.59336.930.82625.003.6554.083.300.78345.043.81633.9363.933.180.75353.902.21645.043.8374.003.430.57365.153.68654.863.7384.043.940.10374.773.76665.083.7393.963.460.50385.183.97675.003.774.083.04395.043.76684.084.040.043.923.360.56405.043.85693.263.34-0.093.322.970.35415.403.62703.853.340.504.283.450.83425.203.67713.803.450.354.153.590.56435.233.66724.784.300.484.364.230.13445.043.81733.482.660.814.523.32455.183.91745.584.483.823.91-0.09465.843.712.13753.342.360.983.703.450.25475.263.60763.280.843.633.150.48485.083.74774.003.780.22203.283.180.10495.203.82785.084.300.78213.653.430.22505.153.74794.303.30223.873.080.79513.764.003.600.40233.343.150.19525.283.525.004.180.82244.003.150.85534.893.824.814.200.60253.673.230.44545.003.672.892.850.05263.182.600.58555.083.843.283.34-0.06274.304.230.07565.043.934.593.49283.703.080.62575.153.70平均值4.443.580.85293.410.30585.043.85////结果显示，6.5℃计数法结果的平均值为4.44log10，最大值为6.93log10，为样品33；最小值为2.89log10，为样品83；结果中位数为4.36log10，为样品15。21℃计数法结果的平均值为3.58log10，最大值为6.11log10，为样品33；最小值为2.36log10，为样品75；结果最大值为2.21log10，为样品35；最小值为-0.09log10，为样品17和样通过SAS9.4对数据进行分析，差值d的分布服从正态分布，P=即差值d分布服从正态分布可以使用Bland-Altman方法分析两种方法的一致性。Bland-Altman分析结果显示（图1两种方法的偏仅2个（2/85，2.35%）数据位于95%置信区间范围外，绝大多数差值都位于偏倚的95%置信区间内，因此可以认为两种培养方法的结果具有较好的一致性，两种方法在实际生产中检测生乳中嗜冷微生图1生乳样品6.5℃计数法和21℃计数法的Bland-Altman分析注：low表示6.5℃计数法，hig对所采集的生山羊乳样品用两种条件进行培养后分别计数，计表5生山羊乳样品嗜冷微生物计数样品6.5℃21℃d17.786.810.9727.307.150.1537.705.572.1347.006.480.5257.006.430.5767.706.870.8376.266.000.2687.707.040.6696.906.890.017.006.590.417.306.920.387.006.720.287.487.040.447.186.280.90平均值7.236.630.61结果显示，6.5℃计数法结果的平均值为7.23log10，最大值为7.78log10，为样品1；最小值为6.26log10，为样品7；结果中位数为最大值为7.15log10，为样品2；最小值为5.57log10，为样品3；结果中位数为6.77log10，为样品1和样品12。两种方法差值d的平均值为0.61log10，最大值为2.13log10，为样品3；最小值为0.01log10，为样通过SAS9.4对数据进行分析，差值d的分布不服从正态分布，P即差值d分布服从正态分布可以使用Bland-Altman比值法分析两种方法的一致性。Bland-Altman分析结果显示（图2两种方法的偏倚为1.09log10，其95%置信区间上限为1.27，下限为0.94，仅1个 （1/14，7.14%）数据位于95%置信区间于偏倚的95%置信区间内，因此可以认为两种培养方法的结果具有较好的一致性，两种方法在实际生产中检测生山羊乳中嗜冷微生物数量时可以互相替代使用。图2生山羊乳样品6.5℃计数法和21℃计数法的Bland-Altman分析对所采集的生绵羊乳样品用两种条件进行培养后分别计数，计表6生绵羊乳样品嗜冷微生物计数样品6.5℃21℃d16.346.2327.30-0.1936.916.670.2447.637.590.0455.996.04-0.0566.626.600.0275.895.540.3486.085.870.2196.155.950.207.327.080.246.946.320.624.704.566.986.430.555.785.320.467.047.040.007.287.200.075.365.79-0.427.157.23-0.086.966.830.13206.826.88-0.06216.906.860.05225.986.08-0.10236.456.79-0.35246.656.570.09255.865.95-0.09265.605.96-0.36276.676.200.47286.796.640.15296.936.590.34305.465.78-0.32平均值6.486.400.08结果显示，6.5℃计数法结果的平均值为6.48log10，最大值为7.63log10，为样品4；最小值为4.70log10，为样品12；结果中位数为6.66log10，为样品24和样品27。21℃计数法结果的平均值为6.40结果中位数为6.50log10，为样品13和样品24。两种方法差值d的平均通过SAS9.4对数据进行分析，差值d的分布服从正态分布，P=即差值d分布服从正态分布可以使用Bland-Altman方法分析两种方法的一致性。Bland-Altman分析结果显示（图3两种方法的偏仅1个（1/30，3.33%）数据位于95%置信区间范围外，绝大多数差值都位于偏倚的95%置信区间内，因此可以认为两种培养方法的结果具有较好的一致性，两种方法在实际生产中检测生绵羊乳中嗜冷图3生绵羊乳样品6.5℃计数法和21℃计数法的Bland-Altman分析对所采集的生驴乳样品用两种条件进行培养后分别计数，计算嗜冷微生物浓度，以对数值表示，其中两种方法的差值用d表示。结表7生驴乳样品嗜冷微生物计数样品6.5℃21℃d17.287.280.0027.157.18-0.0336.386.280.1046.906.570.3356.656.620.0366.976.8676.936.8387.267.080.1894.564.040.514.304.34-0.047.677.570.10平均值6.556.420.13结果显示，6.5℃计数法结果的平均值为6.55log10，最大值为7.67log10，为样品11；最小值为4.30log10，为样品10；结果中位数为6.93log10，为样品7。21℃计数法结果的平均值为6.42log10，最大值为7.57log10，为样品11；最小值为4.04log10，为样品9；结果中位数为6.83log10，为样品7。两种方法差值d的平均值为0.13log10，最通过SAS9.4对数据进行分析，差值d的分布服从正态分布，P=即差值d分布服从正态分布可以使用Bland-Altman方法分析两种方法的一致性。Bland-Altman分析结果显示（图4两种方法的偏都位于偏倚的95%置信区间内，因此可以认为两种培养方法的结果具有较好的一致性，两种方法在实际生产中检测生驴乳中嗜冷微生图4生驴乳样品6.5℃计数法和21℃计数法的Bland-Altman分析对所采集的生骆驼乳样品用两种条件进行培养后分别计数，计表8生骆驼乳样品嗜冷微生物计数样品6.5℃21℃d16.715.990.7224.414.76-0.3436.155.860.2845.760.3655.625.560.0766.045.830.2177.087.15-0.0784.584.490.0996.300.816.810.695.465.260.21平均值6.015.730.28结果显示，6.5℃计数法结果的平均值为6.01log10，最大值为7.11log10，为样品4；最小值为4.41log10，为样品2；结果中位数为6.11log10，为样品4。21℃计数法结果的平均值为5.73log10，最大值为7.15log10，为样品7；最小值为4.49log10，为样品8；结果中位数为5.83log10，为样品6。两种方法差值d的平均值为0.28log10，最大值为0.81log10，为样品9；最小值为-0.34log10，为样品2；中位数为通过SAS9.4对数据进行分析，差值d的分布服从正态分布，P=即差值d分布服从正态分布可以使用Bland-Altman方法分析两种方法的一致性。Bland-Altman分析结果显示（图5两种方法的偏所有数据差值都位于偏倚的95%置信区间内，因此可以认为两种培养方法的结果具有较好的一致性，两种方法在实际生产中检测生骆图5生骆驼乳样品6.5℃计数法和21℃计数法的Bland-Altman分析对所采集的生牦牛乳样品用两种条件进行培养后分别计数，计表9生牦牛乳样品嗜冷微生物计数样品6.5℃21℃d17.747.730.0127.437.48-0.0537.667.410.2547.947.760.1857.157.150.0065.905.660.2378.048.18-0.1386.285.980.30平均值7.277.170.10结果显示，6.5℃计数法结果的平均值为7.27log10，最大值为8.04log10，为样品7；最小值为5.90log10，为样品6；结果中位数为最大值为8.18log10，为样品7；最小值为5.66log10，为样品6；结果中位数为7.45log10，为样品2和样品3。两种方法差值d的平均值为0.10log10，最大值为0.30log10，为样品8；最通过SAS9.4对数据进行分析，差值d的分布服从正态分布，P=即差值d分布服从正态分布可以使用Bland-Altman方法分析两种方法的一致性。Bland-Altman分析结果显示（图6两种方法的偏所有数据差值都位于偏倚的95%置信区间内，因此可以认为两种培养方法的结果具有较好的一致性，两种方法在实际生产中检测生牦图6生牦牛乳样品6.5℃计数法和21℃计数法的Bland-Altman分析ISO17410:2019中指出，21℃计数法除适用于生乳外，对于巴氏杀菌乳产品也同样适用，因此开展了巴氏杀菌乳的验证，结果见表表10巴氏杀菌乳样品嗜冷微生物计数样品6.5℃21℃d12.6722.610.9632.6142.6052.4562.4872.280.9482.5392.402.542.040.502.602.200.792.682.340.912.230.652.49平均值2.48结果显示，对于巴氏杀菌乳样品，6.5℃计数法结果的平均值为2.48log10，最大值为2.68log10，为样品13；最小值为2.20log10，为样品12；结果中位数为2.51log10，为样品8和样品16。21℃计数法结果的平均值为1.43log10，最大值为2.04log10，为样品10；最小值为1.04log10，为样品6；结果中位数为1.42log10，为样品12和样品14。最小值为0.50log10，为样品10；中位数为1.07log10，为样品3和样品通过SAS9.4对数据进行分析，差值d的分布服从正态分布，P=0.8225>0.05，可以使用Bland-Altman方法分析两种方法的一致性。95%置信区间上限为1.56log10，下限为0.54log10，仅1个（1/16，6.25%）数据位于95%置信区间范围外，绝大多数差值都位于偏倚的95%置信区间内，因此可以认为两种培养方法的结果具有较好的一致性，两种方法在实际生产中检测巴氏杀菌乳中嗜冷微生物数量时图7巴氏杀菌乳样品6.5℃计数法和21℃计数法的Bland-Altman分析准确度通过参考方法的结果与待确认方法的结果之间的比较研究，使用人工污染样品进行。选择6个测试样品，其中2个样品为低浓度污染水平，2个为中间浓度污染水平，2个为高浓度污染水平，每个样品重复测试5次，结果见表11，计算β-期望容差区间(β-expectationtoleranceinterval，β-ETI表12并绘制准确度分布图表11人工污染样品嗜冷微生物计数样品编号6.5℃计数法21℃计数法x1x2x3x4x5y1y2y3y4y51（低水平）4.184.084.184.083.853.853.913.953.812（低水平）4.204.154.264.154.183.683.953.933.893.753（中水平）5.785.855.895.835.935.465.515.415.455.494（中水平）5.615.435.535.545.485.845.905.815.885.795（高水平）8.738.648.748.568.638.368.268.288.308.416（高水平）8.798.748.638.648.548.408.368.348.238.28表12β-期望容差区间样品编号XSrefALsYSvalBULAL1（低水平）0.050.203.850.06-0.26-0.16-0.360.50-0.502（低水平）4.180.050.183.89-0.29-0.19-0.390.50-0.503（中水平）5.850.060.235.460.04-0.39-0.29-0.490.50-0.504（中水平）5.530.070.285.840.050.310.410.210.50-0.505（高水平）8.640.080.318.300.07-0.34-0.24-0.440.50-0.506（高水平）8.640.100.388.340.07-0.30-0.20-0.400.50-0.50注：X表示6.5℃计数法结果的中位值，Sref表示6.5℃计数法结果的合成标准差，ALs表示6.5℃计数法新的接受限（ALs=±4×SrefY表示21℃计数法结果的中位值，Sval表示21℃计数法结果的合成标准差，B图8准确度分布图由图3可知，对于所有样本，其β-ETI的上限值≤AL，上限值≥-AL，可认为21℃计数法与6.5℃计数法三、试验验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效益、社会效益和生态效益。三家实验室分别为新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所加4株假单胞杆菌，制备出4log10、5log10、8log10高中低三个浓度水平，每个浓度水平检测2个平行考察方法的准确度，结果见表13~表15。根据《食品安全国家标准微生物检验方法验证通则》（GB/T4789.45—2023）要求，计算三家实验室结果的准确度（表16~表表13方法再现性考察验证试验结果（Lab1）样品6.5℃计数法21℃计数法计算值Log10值计算值Log10值计算值Log10值计算值Log10值低水平1.2×1044.084.064.6×1033.664.9×1033.694.2×1055.623.3×1055.522.6×1055.412.9×1055.46高水平4.5×1088.654.4×1088.642.4×1088.382.1×1088.32表14方法再现性考察验证试验结果（Lab2）样品6.5℃计数法21℃计数法计算值Log10值计算值Log10值计算值Log10值计算值Log10值低水平1.5×1044.181.3×1043.715.0×1033.706.2×1055.797.2×1055.862.7×1055.432.6×1055.41高水平3.8×1088.583.6×1088.562.3×1088.362.1×1088.32表15方法再现性考察验证试验结果（Lab3）样品6.5℃计数法21℃计数法计算值Log10值计算值Log10值计算值Log10值计算值Log10值低水平1.5×1044.181.3×1045.4×1033.736.5×1033.813.8×1055.583.7×1055.572.6×1055.412.5×1055.40高水平3.5×1088.543.7×1088.573.0×1088.482.7×1088.43表16实验室间验证样品6.5℃计数法准确度污染水平低中高X5.668.590.0320.0390.0120.0210.10.0330.0380.1070.035r0.090.03R0.30.1ALs0.130.35注：X表示6.5℃计数法结果的平均值，Sr表示表17实验室间验证样品21℃计数法准确度污染水平低中高Y3.715.428.380.0270.0170.0280.02900.0410.040.0170.049r0.080.050.08R0.05STI0.0420.0180.053df6.388.895.5B-0.41-0.24-0.21U-0.35-0.22-0.13L-0.47-0.27-0.290.50.50.5AL-0.5-0.5-0.5注：Y表示21℃计数法结果的平均值，ST图9准确度分布图AL，可认为21℃计数法与6.5℃计数法目前，乳中嗜冷微生物检测主要根据NY/T1331—2007进行，需要在6.5℃需氧培养10天。该方法耗时较长，对牧场来说，得到的是10d之前的嗜冷微生物污染数据，无法实现根据污染情况实时调整牧场管理；而乳企在得到培养计数结果时，该批次生乳已加工为产品，甚至有可能已经被售卖给消费者，嗜冷微生物产生的耐热在本标准中，采用ISO17410-2019附录B提出的建立乳中嗜冷微生物快速检测方法，对指导牧场开展嗜冷微生物污染防控和乳企明确嗜冷微生物污染，降低由此导致的乳及乳制品腐败浪费具有重要意义。从本次调查的结果来看，嗜冷微生物污染在生乳中普遍存在，可能会对后续加工而成的乳品造成影响。通过本标准的应用，在乳品加工前探明嗜冷微生物污染程度，对保障四、与国际、国外同类标准技术内容的对比情况，或者与测试的国外样品、样机的有关数