病理检验技术（第3版）课件 第12章 免疫细胞和组织化学技术

免疫细胞和组织化学技术第一节 概述免疫细胞和组织化学技术又称免疫细胞化学，习惯简称为免疫组化，是指用标记的特异性抗体(或抗原)在组织细胞原位通过抗原抗体反应，对相应抗原(或抗体)以及其他物质进行定性、定位、定量测定的一项新技术。基本原理免疫组化技术利用抗原与抗体特异性结合的特点免疫组化技术利用抗原与抗体特异性结合的特点或半抗原注入另一种动物体内，使之产生与该抗原相应的特异性抗体;将抗体从动物血清中提出，结合上某种标记物，即成为标记抗体。用标记抗体与组织切片标本孵育(染色)，抗体则与细胞中相应抗原发生特异性结合，结合部位被标记物显示，借助显微镜(包括电子显微镜)可以观察到该物质的分布、含量。组织或细胞内凡是能作为抗原或半抗原的物质都可用免疫组化的方法进行检测，如多肽、蛋白质、受体、多糖、酶、激素、病原体等。第二节免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光标记物与细胞或组织内的相应抗原(或抗体)起反应。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，从而确定抗原或抗体的性质、位置，并可以利用定量技术测定其含量。用荧光抗体检查相应抗原的方法称荧光抗体法;用已知的荧光抗原标记物检查相应抗体的方法称荧光抗原法。免疫荧光组化技术染色方法分为：直接法、间接法、补体法和双重荧光标记法。是免疫荧光组化技术最简单和基本的方法。把荧光抗体(或抗原)滴加于待检标本片上，直接与细胞或组织中相应抗原(或抗体)结合，洗涤后在荧光显微镜下即可见抗原(或抗体)存在部位呈现特异性荧光(图1)。此法常用于细菌、病毒等的快速检查和淋巴细胞表面抗原与受体的鉴定。直接法间接法用已知抗体检测未知抗原时，先用特异性抗体(第一抗体，简称“一抗”)与相应抗原结合，再用荧光素标记的抗特异性抗体(第二抗体，简称“二抗”)与特异性抗体结合，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光(图2)。补体法(一)直接检查组织内免疫复合物法将抗补体C3的荧光抗体与组织切片中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，形成抗原抗体补体复合物抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等(图3)。(二)间接检查组织内抗原法将新鲜补体与第一抗体的混合液加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用荧光素标记的抗补体抗体与结合的补体反应，形成抗原—抗体—补体—抗补体荧光抗体的复合物。此法的优点是只需一种荧光抗体即可适用于各种不同种属来源的第一抗体。第三节免疫酶组织化学技术免疫酶组化技术是通过运用抗原抗体特异性反应，借助酶组织细胞化学的手段，检测抗原或抗体在组织细胞内存在部位的一门新技术。其基本原理是预先将抗体与酶联结，制成酶标抗体，再利用酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，然后借助光镜或电镜进行观察，以对细胞内或细胞表面的抗原或抗体进行定位。本方法敏感性高，染色标本可以长时间保存，已成为免疫组化最常用的方法之一。直接法

基本原理是将酶标记的特异性抗体直接与待检测组织细胞内的特定抗原结合，再通过与酶的底物作用生成有色的不溶性产物，沉积在抗原抗体反应部位，从而对抗原进行定性、定位以及定量研究。直接法具有操作简便、快速、特异性强、非特异性背景反应低等优点，常应用于检查肾活检标本中的抗体或补体成分，亦用于系统性红斑狼疮等结缔组织疾病的检查。间接法基本原理是先用特异性抗体(一抗)与组织中的抗原反应，再用酶标记的抗特异性抗体(二抗)与一抗反应，形成抗原—抗体—酶标抗抗体复合物，最后通过酶的底物显色。因为对于同一种属动物不同种类的第一抗体，只要用一种酶标抗抗体就能显示不同特异性抗原的存在。因此，间接法与直接法相比更具有实用性，在酶标抗体染色中最为常用。PAP法基本原理是特异性抗体(一抗)与组织中的抗原结合后，将桥抗体(二抗)结合其上，桥抗体再与酶及其抗体制成的复合物(PAP)连接起来，最后经过底物的呈色反应将抗原显示出来。双桥PAP法该法是PAP法的改良，操作与单桥法基本相似，所不同的是切片经单桥PAP复合物孵育后，漂洗，再孵育桥抗体和PAP复合物(均可稀释1倍)，即切片经两次桥抗体、两次PAP孵育。双桥法可结合更多的PAP于抗原分子上，从而使敏感性增强，对于组织细胞中微量抗原的检测具有实用价值。第四节亲和免疫组织化学技术

亲和免疫组化技术是利用两种物质之间的高度亲和特性，将酶、荧光素等标记物与亲和物质连接，对抗原或其他靶物质进行定位和定量的方法。ABC技术其原理是先将生物素与HRP结合，形成生物素化的HRP，再与卵白素按一定比例混合，即形成ABC复合物。然后将生物素化的二抗与特异性一抗结合，再与ABC复合物连接，形成抗原—特异性抗体—生物素化二抗—ABC复合物，最后进行显色反应定位。SP法SP法又称为标记的链霉卵白素—生物素(LSAB)法。其染色原理和操作步骤与ABC法相同，只是用链霉菌抗生物素蛋白代替了ABC复合物中的抗生物素，即将生物素化的HRP和链霉菌抗生物素蛋白混合，形成SP复合物，再用生物素化的二抗将特异性一抗和SP复合物连接起来，最后用底物显色剂显色，从而显示抗原的位置。SPA法SPA能与某些哺乳动物IgG的Fc段非特异性结合，也能与人的IgG1、IgG2和IgG4结合。另一方面，酶、荧光素、胶体金等可以标记在SPA上，使之成为免疫组化中有用的工具。如SPA可用在PAP法中代替桥抗体;标记SPA可直接检测组织细胞内的IgG成分或免疫复合物。而且，它具有操作简便、染色时间短、灵敏度高和背景着色浅的优点。第五节免疫组化染色中常见问题及其处理一、组织处理组织标本的取材和固定是否及时是防止组织自溶和抗原丢失的关键，也是做好免疫组化染色的第一步。取材

离体组织取材最好在2小时内。取材时，要一刀切开组织，以减少对组织的挤压。组织块大小、厚度要适中，厚度一般不要超过0.2cm，以利于组织的均匀固定。2.固定用于免疫组化的固定剂很多，最好根据抗原的耐受性选择相应的固定液，但在临床病理的实际工作中，通常是在常规HE染色后决定是否进行免疫组化染色，固定剂一般都是用4%甲醛液，此时，固定时间最好在12小时以内，否则，随固定时间的延长，组织抗原的检出率会逐渐下降。另外，组织固定后要充分冲洗，去除固定剂，以免固定剂对染色造成影响。3.脱水、透明、浸蜡

脱水、透明要充分，浸蜡的时间和温度需严格控制，不能过度，否则既影响抗原定位的准确性，又因组织硬、脆而致切片不完整，染色时容易脱片。一般组织块无水乙醇脱水共3步，每步1小时;二甲苯透明15～30分钟;浸蜡及包埋用石蜡温度不超过60℃，常用低熔点的软蜡包埋。二、制片(一)载物片的处理在免疫组化染色中，如果载物片没有处理好，很容易发生脱片。可以根据情况，选择下列一种方法预先处理载物片。1.多聚左旋赖氨酸2.明胶硫酸铬钾法3.氨丙基—乙氧基甲硅烷(APES)法(二)切片切片刀要锋利，切成的切片要完整，应无皱褶、无刀痕，否则，染色时可出现假阳性。切片厚度一般在3～5μm，太厚会影响对染色结果的判断，染色时还容易发生脱片。三、染色在免疫组化染色过程中，要注意以下几方面的问题。(一)去除内源性酶及内源性生物素1.去除内源性2.去除内源性3.灭活碱性磷酸酶(二)抑制非特异性背景着色非特异性背景着色最常见的情况是抗体吸附到组织中高度荷电的胶原和结缔组织上。为了防止这种情况的发生，最好的办法是用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，阻止一抗与之结合。但一般实验室常用的是2%～10%羊血清或2%牛血清白蛋白，在室温下作用10～30分钟。须注意此种结合是不牢固的，所以不要冲洗，倾去余液后直接加一抗。使用多克隆抗体，更易产生背景着色，在稀释抗体时可使用含1%非免疫血清的pH为7.4的PBS液。冲洗

3分钟，2次。(三)缓冲液抗原抗体反应最合适的pH为7.2～7.6。免疫组化最常用的缓冲液是0.01mol/LpH为7.4磷酸盐缓冲液(PBS)，其简易配制方法为:将NaH2PO41g、Na2HPO415.6g、NaCl42.5g分别加入5000ml蒸馏水中即成。若采用AKP作为标记物底物，用0.02mol/LpH为8.2的TBS缓冲液较好。(四)抗原修复甲醛在固定组织时会封闭部分抗原决定簇，因此，在染色时，有些抗原需要先进行修复或暴露，以利抗原抗体最大限度地结合，增强特异性染色。目前常用的抗原修复方法有以下几种。胰蛋白酶法2.胃蛋白酶法3.热诱导的抗原修复(HIAR(1)水浴加热法(2)微波加热法(3)高压加热法。(五)抗体的选用、分装、稀释及保存抗体是免疫组化技术中最重要的试剂。使用新的抗体前，应该了解其工作浓度范围，还应根据实验室的条件，确定最佳稀释度，以获得最强的特异性染色和最弱的背景染色。另外，还要注意抗体的保存，防止抗体的效价过快地降低。抗体的选用多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反应较明显，

但其价格低廉，效价较高，

稀释度一般在(1：100)～

(1：1000)，适应性强。

单克隆抗体的抗原专一性强，

质量和效价稳定，非特异性反应较少，

但其价格昂贵，效价较低，

稀释度一般在(1：50)～(1：100)。2.抗体稀释抗原抗体的结合反应与两者之间的分子比例有密切的关系，如果抗体分子过多，阳性反应反而减弱，甚至呈假阳性。因此选择适当的抗体稀释度，不仅能节省抗体，而且还可以获得满意的染色效果。（1）影响抗体稀释度的因素:①抗体的浓度(滴度)：抗体的浓度越高，稀释度就越高。②抗体溶液中非特异性蛋白的含量：非特异性蛋白也能吸附在组织结构上，引起背景的非特异性染色。因此，宜选用效价高、稀释度高的抗体，以减低背景染色。③孵育时间：如适当延长孵育时间，抗体的稀释度可相应提高。④染色方法：免疫组化染色方法的灵敏度高，所用抗体的稀释度也可随之提高。（2）抗体最佳稀释度的测定方法1）直接测定法2)棋盘测定法3)抗体稀释液的配制3.抗体的分装和保存(六)孵育方法及时间抗体孵育应在特制的湿盒内进行，以免切片因水分蒸发、干燥而导致染色失败。孵育时间常为1小时左右，孵育温度为室温或37℃。可根据抗体的效价和检测方法的灵敏度进行适当的延长或缩短，延长孵育时间可在4℃冰箱过夜。近年来，由于微波技术在免疫组化染色中的应用，使得抗体孵育时间大为缩短，提高了检测速度。(七)显色显色是免疫组化染色最后的关键步骤。一般地，HRP的显色采用DAB或AEC显色系统。免疫组化常用的显色剂有以下两种。1.3，3'二氨基联苯胺(DAB2.3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)四、其他常见问题(一)对照试验的设置常设的对照如下。1.空白对照第一抗体由PBS取代，结果应为阴性。2.阴性对照用已知抗原阴性的标本与待检标本同时染色，结果应为阴性。3.阳性对照用已知含有待检测抗原的切片与待检标本同样处理，做免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。4.吸收试验阴性对照用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合位点全部被抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原发生反应，用其做免疫组化染色，结果应为阴性。此种对照因抗原来之不易，较少使用。5.替代对照用一抗动物免疫前血清或同种动物与待测抗原无关的抗体替代一抗，结果应为阴性。6.自身对照在同一切片上，将不同组织成分中的阳性或阴性结果与检测目的物进行对照比较，如actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性；desmin可以与血管壁及肌束对照等。如果应为阳性的组织是阳性，表明免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。(二)结果的判断免疫组化结果的判断尚无统一标准，一般有两种方法:一种方法是以检测结果阳性细胞指数来定性，即以一个视野中的阳性细胞数与总细胞数的百分比，再取10个相同视野算得平均指数。第二种方法是以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般地，阳性细胞数少于25为阴性，25～50为+，50～75为+