临床输血检验技术 课件 项目十一 新生儿溶血病实验室检查

新生儿溶血病实验室检查掌握：新生儿溶血病的定义、实验室检查。熟悉：新生儿溶血病的发病机制、临床表现。了解：新生儿溶血病的治疗和预防。能做到新生儿溶血病实验室检查项目的正确选择和初步判断。学习目标任务一新生儿溶血病狭义广义各种病因使胎儿或新生儿红细胞破坏增多的疾病，病因包括母婴血型不合、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、遗传性球形红细胞增多症、地中海贫血等.指母婴血型不合引起的溶血病，临床上以母婴血型不合引起的最为常见。新生儿溶血病（HemolyticDiseaseoftheNewborn，HDN）抗体红细胞新生儿溶血病——发病机制ABO系统HDN90%以上发生于O型母亲孕育了A型、B型或AB型的胎儿ABO血型不合引起的HDN在Rh血型不合溶血病中以D抗原不合最为多见，临床表现也最严重Rh血型不合的HDN由于胎儿从父体遗传获得母体缺乏的显性抗原发病机制产道损伤胎儿红细胞进入母体产生的IgG抗体，抗原抗体结合细胞溶血ABO血型Rh血型通过胎盘进入胎儿体内。新生儿溶血病——临床表现临床特点ABO血型不合HDNRh血型不合HDN发生频率常见不常见发生的母子血型主要发生在母亲O型，胎儿A型或B型母亲缺少任一Rh抗原，胎儿具有该Rh抗原发生胎次第—胎可发病(约半数)—般发生在第二胎，但第—胎亦可发病下一次情况不—定大多数更严重临床表现较轻较重，严重者甚至死胎黄疸—般出生后2～3天出生24小时内出现并且迅速加重贫血较轻严重贫血伴心力衰竭肝脾肿大少见多有不同程度的肝脾大晚期贫血少见可发生，持续至出生后3～6周HDN的胎儿红细胞破坏增多，机体运输氧的能力下降，造成组织缺氧，引起一系列病变新生儿溶血病——临床表现HDN除了新生儿黄疸出现早以外，血清胆红素水平在短时间内快速上升也是其特点黄疸HDN由于胎儿对红细胞破坏增加的反应是增加红细胞生成速率，对红细胞需求的增加可引起髓外造血，因此患儿常有肝脾大，Rh血型不合导致的HDN肝脾肿大更明显。肝脾肿大病死率高，存活的患儿恢复后期可出现手足徐动、眼球运动障碍、听觉障碍或牙釉质发育不良等后遗症。胆红素脑病患儿出生后精神萎靡、嗜睡、少吃、少哭；有的出生后不久即发生心力衰竭。严重者可危及生命。贫血孕妇在妊娠期体重增加迅速，提示有胎盘水肿的可能性，胎盘和新生儿体重之比在1:7以下。水肿儿多会早产，少数足月娩出，在母体或出生后全身水肿，在胸腔、腹腔和心包腔内出现积液，皮肤苍白、肝脾肿大，呼吸困难，预后差，死亡率高。水肿新生儿溶血病——治疗与预防(治疗)治疗目的：一是预防或缓解胎儿产生严重贫血、水肿，降低胎死宫内几率，从而缓解胎儿出生后的一些严重并发症；二是预防或缓解新生儿因高胆红素血症引起的脑部损伤。光照疗法药物治疗血液治疗方法：让患儿裸体睡于蓝光箱中央，光源距婴儿体表50cm，两眼及外生殖器用黒罩或黑布遮盖。箱周温度应保持在30-32℃，每小时测肛温1次，使体温保持在36.5-37.2℃之间。可连续照射24-72小时。肾上腺皮质激素：能阻止抗原与抗体反应减少溶血，能促进肝细胞葡萄糖醛酸转移酶对胆红素的结合能力。酶诱剂：能诱导肝细胞滑面内质网中葡萄糖醛酸转移酶的活性，降低血清非结合胆红素。其他：丙种球蛋白、白蛋白、中药等。换血疗法：ABO血型不合溶血症选用O型悬浮红细胞与AB型血浆混合后的血液。血液制品与血液制剂输注：可输注血浆或（和）白蛋白。新生儿溶血病——治疗与预防(预防)预防方法胎儿期药物预防、血浆置换、宫内输血、酶诱导剂、提前分娩、终止妊娠等出生后新生儿ABO溶血病：出生早期监测胆红素，达到光疗标准时及时光疗新生儿Rh血型不合溶血病：RhD抗原阴性妇女在娩出RhD阳性新生儿后72小时内，肌内注射IgG抗D血清，再次妊娠29周时可再肌注1次效果更好，可避免抗体的产生。任务二新生儿溶血病的实验室检查一、常规检查表10-2夫妻ABO、Rh血型是否相合的判断

血红蛋白降低，一般<145g/L，红细胞计数降低，网织红细胞常增多。外周血涂片可见有核红细胞。白细胞计数可增高，血小板计数可正常。

胆红素测定包括新生儿产前羊水及脐带血检测，羊水检测可预测子宫内的溶血情况，胆红素浓度越高，溶血越重；新生儿脐血胆红素测定，可诊断新生儿病理性黄疸及程度，是治疗的依据。血常规检查胆红素测定新生儿溶血病的实验室检查常规检查产前血型血清学检查——血型鉴定血型鉴定：血型鉴定包括夫妻双方的ABO血型系统和Rh血型系统，以预测母婴之间是否可能存在血型不合。条件允许可做胎儿羊水ABO血型物质检查，进一步排除ABO血型不合的HDN。妻子血型丈夫配合血型丈夫不配合血型OOA、B、ABAO、AB、ABBO、BA、ABABO、A、B、AB—Rh阳性Rh阳性、Rh阴性—Rh阴性Rh阴性Rh阳性表10-2夫妻ABO、Rh血型是否相合的判断产前血型血清学检查——母亲血清中Ig抗体效价测定母亲血清中Ig抗体效价测定IgG抗A/抗B效价测定Rh血型不规则抗体及效价检测被检血清以2-巯基乙醇（2-Me）或二硫苏糖醇（DTT）处理后，IgM类抗体分子裂解为6-7S亚单位。此种亚单位虽然保持与抗原结合的能力，但已失去与其相应红细胞凝集的作用。IgG抗体分子则不被2-Me或DTT灭活，保持与相应红细胞致敏的血清特性。采用抗人球蛋白法检测IgG类抗A和（或）抗B效价。IgG抗A/抗B效价测定【标本】

孕妇不抗凝静脉血，标本量≥3ml。1.器材

血清学专用离心机、37℃水浴箱、试管架、试管(10mm×60mm)、记号笔、显微镜、塑料吸管、玻片、微量加样器、微柱凝胶孵育器、微柱凝胶离心机等。2.试剂pH7.4PBS液、0.2mol/L2-巯基乙醇（2-Me）应用液或1.0mol/L二硫苏糖醇（DTT）、抗球蛋白血清试剂、5%A、B型红细胞生理盐水悬液等。用盐水介质排除IgM型抗体的血清，若还有Rh血型不完全抗体可与相应红细胞结合，红细胞被致敏，由于抗原抗体复合物分子小、不能形成肉眼可见的凝集现象。加入抗人球蛋白，使红细胞出现肉眼可见的凝集，从而筛查出红细胞血型抗体。一旦抗体被检出，应做抗体鉴定试验。Rh血型不规则抗体及效价检测1.器材：37℃水浴箱、离心机、显微镜、玻片、试管架、(10mm×60mm)、记号笔、蜡笔、微量加样器、一次性塑料吸管、微柱凝胶卡专用孵育器、微柱凝胶离心机等。2.谱红细胞、IgG包被的红细胞、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）、0.2mol/L2-巯基乙醇（2-Me）应用液或1.0mol/L二硫苏糖醇（DTT）、抗球蛋白血清试剂、生理盐水等。夫妇双方EDTA抗凝血3-5ml制备红细胞悬液，孕妇不抗凝血3-5ml分离血清。【标本】

产前血型血清学检查——IgG抗A/抗B效价测定处理血清经典抗人球蛋白法：操作流程观察结果加标准红细胞倍比稀释排列试管结果判断洗涤红细胞加PBS加抗球蛋白血清离心并观察结果4+：红细胞凝集成结实大凝块，背景清晰透明，无游离红细胞。3+：红细胞凝集成数个凝块，背景尚清晰，极少游离红细胞。2+：红细胞凝块分散成许多中小凝块，背景稍混浊，周围可见到游离红细胞。1+：肉眼可见大颗粒，背景混浊，镜下许多凝集，有较多游离红细胞。－：红细胞呈均匀悬液，镜下未见红细胞凝集，红细胞均匀分布。（1）稀释操作时要准确，避免稀释不匀，出现“跳管”现象。（2）2-Me或DTT应用液每次开瓶后要一次用完。（3）IgG抗A(B)效价测定，第1管的血清是用等体积的2-Me或DTT应用液破坏，故已经稀释一倍，所以起始效价为2。检测结果判断标准质量检测产前血型血清学检查——IgG抗A/抗B效价测定微柱凝胶抗人球蛋白法：操作流程处理血清倍比稀释排列试管取Coombs微柱凝胶卡离心10分钟加血清与红细胞悬液凝胶卡孵育15分钟取出并观察4+：红细胞复合物（凝集）位于凝胶表面。3+：大部分红细胞复合物位于凝胶表面，少部分位于凝胶中上部。2+：大部分红细胞复合物位于凝胶中部，少部分位于凝胶中上部。1+：红细胞复合物位于凝胶中下部分。－：红细胞完全沉积在凝胶管尖底部。（1）微柱凝胶卡必须保存在室温中，使用前应检查微柱凝胶卡是否胶质均匀、胶面整齐、有无气泡等。（2）红细胞标本避免受细菌污染．否则易出现假阳性。（3）在微柱凝胶卡中出现溶血现象，提示为红细胞抗原-抗体反应，但也不排除其他原因所致溶血，需作认真分析。检测结果判断标准质量检测产前血型血清学检查——Rh血型不规则抗体及效价检测【操作】红细胞用生理盐水洗涤3次，配制5%红细胞悬液压积红细胞加入最适稀释度抗球蛋白血清试剂1滴，充分混合。加入母亲血清1滴。红细胞悬液各1滴，混匀。若无凝集，孵育30分钟，洗涤3次，最后一次洗涤，弃去上清液，保留压积红细胞。以相对离心力1000g离心15秒，观察结果。若有凝集，取母体血清0.2ml，加2-Me或DTT应用液0.2ml混合，封口温放置30分钟.以1000g离心15秒，轻轻悬浮细胞，摇动试管，观察结果。若检出不规则抗体如Rh抗体接着做效价检测，检测方法参考IgG抗A/抗B效价测定。阳性者用谱红细胞对母体血清进行特异性分析，以判断是否存在Rh抗体。阴性者应加IgG包被的红细胞1滴，离心并观察结果：凝集，表示阴性结果可靠；不凝集，表示试验无效，必须重做。有溶血和凝集为阳性，否则为阴性。【方法学评价】本试验将盐水法与抗人球蛋白法相结合，盐水法反应迅速、方便，但只能检出IgM抗体，抗人球蛋白法对于检查IgG抗体最可靠，但操作步骤稍繁琐。产后血型血清学检查——“三项试验”“三项试验”红细胞直接抗人球蛋白试验（DAT）血浆（血清）游离抗体试验红细胞抗体释放试验新生儿血清学“三项试验”“三项试验”，是对新生儿溶血病的患儿血清学进行的检测。包括直接抗人球蛋白试验（简称直抗试验）、游离试验和释放试验。在盐水介质中，不完全抗体可以致敏人红细胞，但不能让红细胞凝集。将抗人球蛋白试剂加入红细胞悬液中，在致敏红细胞间搭桥，使已被不完全抗体致敏的红细胞出现肉眼可见的凝集，而未被抗体包被的红细胞则不会出现凝集。红细胞直接抗人球蛋白试验（DAT原理)【标本】【器材与试剂】受检者不抗凝血，采血量≥3ml。1.器材

血清学专用离心机、37℃水浴箱、试管架、试管(10mm×60mm)、记号笔、显微镜、塑料吸管、玻片、微量加样器、微柱凝胶孵育器、微柱凝胶离心机等。2.试剂多特异性抗球蛋白试剂或抗-IgG和抗-C3d单价抗球蛋白血清、IgG抗-D致敏的2％～5％RhD阳性红细胞悬液、2％～5％正常人红细胞悬液、生理盐水、Coombs微柱凝集卡等。红细胞直接抗人球蛋白试验产后血型血清学检查——“三项试验”【操作】试管法：配成5%红细胞盐水悬液阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集标明试管属性均匀分布为阳无凝集则为阴各管加不同的悬液各1滴各管加球蛋白试剂1滴，1000g离心15s秒方法同多特异性抗球蛋白试剂配0.8%红细胞悬液1000r/min离心10分钟标记检测孔、阳性孔和阴性孔置于微柱凝胶孵育器内，37℃孵育15分抗多特异性球蛋白试剂50ul红细胞悬液分别加入检测孔、阳性孔和阴性孔取出微柱凝胶卡观察结果微柱凝胶介质法:洗涤三次50ul待检全血0.8%红细胞悬液孵育离心观察结果加入抗多特异性球蛋白试剂50ul微柱凝胶介质法试验流程产后血型血清学检查——“三项试验”用新生儿血清加上A、B型试剂红细胞悬液，做酶法或间接抗人球蛋白试验，并以此试验来验证新生儿血清中是否存在与其红细胞不配合的IgG抗-A或抗-B，这些来自于母亲的IgG抗体可与新生儿红细胞结合，引起新生儿溶血病。血浆（血清）游离抗体试验指示红细胞意义ABO+--游离的抗A-+-游离的抗B++-游离的抗A、抗B或有抗AB+/-+/-+游离的ABO系统以外抗体---无游离抗体表10-4游离抗体检测意义血浆或血清游离抗体试验【器材与试剂】

用新生儿血清加上A、B型试剂红细胞悬液，做酶法或间接抗人球蛋白试验，并以此试验来验证新生儿血清中是否存在与其红细胞不配合的IgG抗-A或抗-B，这些来自于母亲的IgG抗体可与新生儿红细胞结合，引起新生儿溶血病。游离抗体检测的意义见表10-4.产后血型血清学检查——“三项试验”【标本】

受检者不抗凝血，采血量≥3ml。离心分离血清备用微柱凝胶卡放入微柱凝胶孵育器内，37℃孵育15分钟.取Coombs凝胶卡一张分别标记Ac、Bc、OcAc、Bc、Oc各加血清50ul，相应红细胞悬液各50ul1000r/min离心10分钟，取出Coombs微柱凝胶卡观察记录结果微柱凝胶介质法:孵育离心判读结果ABoAc丨Bc丨Oc丨微柱凝胶介质法【操作】试管法：离心分离血清备用若某管出现凝集，说明有相应的盐水抗体取3支试管，分别标记Ac、Bc、Oc加入5％A、B、O型试剂红细胞悬液各1滴，37℃30min1000g离心15秒，肉眼及显微镜下观察产后血型血清学检查——“三项试验”

红细胞抗体释放试验是诊断HDN的主要依据。释放试验结果阳性应诊断HDN。因致敏红细胞通过某种方法将抗体释放出来，而释放液中抗体的特异性可用已知抗原的红细胞来确定。常用的方法有：加热放散法、冷放散法和乙醚放散法。

红细胞抗体释放试验红细胞抗体释放试验产后血型血清学检查——“三项试验”【操作】加热放散法：红细胞洗涤3次，3000r/min离心5分，加入等量的生理盐水，混匀分离上清液置于另一支试管中即为放散液置于56℃水浴振摇10分钟立即以1000g离心2分钟取洁净试管3支

加入相应的酶处理红细胞1滴，37℃孵育30min洗涤3次，弃上清，各管加入多特异性抗人球蛋白试剂2滴

以1000g离心15秒，观察结果【原理】

结合在红细胞上的抗体可以采用加热的方式进行分离，然后再进行抗体种类鉴定。用生理盐水洗涤待检标本红细胞，将离心后形成的压积红细胞放入56℃水浴中振摇一定时间后，再高速离心后取上清液与已知红细胞反应看是否凝集来鉴定放散液中抗体的种类。常用于AB0-HDN抗体放散试验。【标本】受检者抗凝血，采血量≥3ml。加热放散法ErythrocytewithboundantibodsElutionofantibodiesbyheatDissociatedantibodies【器材与试剂】（1）器材

血清学专用离心机、37℃水浴箱、56℃水浴箱、试管架、试管(10mm×75mm)、记号笔、微量加样器、一次性塑料滴管等。（2）试剂

生理盐水、（A、B、O）2％～5％酶处理指示红细胞、多特异性抗人球蛋白试剂等。Destroyederythrocyte产后血型血清学检查——“三项试验”盐水洗涤3次，3000r/min离心5分钟，弃上清，加等体积的盐水和2倍无水乙醚紧试管口振摇10分钟取另一支试管，加入放散液2滴，再加标准谱红细胞悬液1滴，37℃孵育30分钟，弃上清，加抗人球蛋白血清1滴离心力1000g离心5分钟取试管上层为乙醚层

中间层为红细胞层，下层为放散液层下层深红色的放散液移至另一支试管中置于37℃孵育30分钟，除尽乙醚。离心力1000g离心15秒，轻弹试管，肉眼观察，必要时在显微镜下观察，记录凝集情况【操作】乙醚放散法：乙醚放散法ErythrocytewithboundantibodsElutionofantibodieswithether【原理】乙醚为有机溶剂，通过破坏红细胞膜，使结合在红细胞膜上的IgG抗体解离，再应用标准谱红细胞测定放散液中抗体的特异性。可检测吸附于红细胞上的各种IgG抗体。常用于Rh-HDN抗体放散试验。【标