DNA杂交技术及应用

DNA杂交技术及应用摘要：主要介绍DNA杂交技术的原理，在分开简单介绍Southern杂交、Northern杂交的技术原理和主要的技术过程。最后简单的举例他们在实践中的运用。关键词：Southern杂交Northern杂交杂交技术应用Abstract:IntroducestheprincipleofDNAhybridizationtechnique,andSeparateintroducetheprincipleandthemaintechnicalprocessofsouthernblottechnique,northernblottec-htechnique.Atlastusesomeexampletoshowtheiruseinpractice.Keywords:southernblottechniquenorthernblottechniqueuseofhybridizationtechnique互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。是指把不同来源的DNA分别加热100℃或调节pH到大于13时，DNA会变性解离成单链,再把两种来源的DNA单链放到一起，在60℃保持相当长时间,互补的DNA单链就会重新形成双螺旋结构，我们把它叫杂合双链，这即是两个DNA具有相同碱基对排列顺序的部分。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测[1]。1.1Southern杂交该法是将DNA片段电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜(NCM)或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检测对象为DNA，探针为DNA或RNASouthern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量[2]。Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。 1.2Northern杂交 该法是将RNA片段电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检测对象为RNA，探针为DNA或RNA。Northern印迹杂交（Northernblot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblot。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在上样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。2.1Southern杂交主要过程1待测核酸样品的制备（1）制备待测DNA（2）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA2电泳凝胶预处理a.如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理(1)把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植物基因组DNA≤20分钟(2)把凝胶浸在灭菌双蒸水中b.如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤(1)把凝胶浸在变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动(2)把凝胶浸在灭菌双蒸水中(3)把凝胶浸在中和液中（0.5mol/LTris-HCl，Ph7.5，1.5mol/LNaCl），室温2×15分钟(4)在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟3琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品(1)制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA样品与上样缓冲液混匀，上样(2)分子质量标志物（DIG标记）上样(3)电泳，使DNA条带很好的分离(4)评价靶DNA的质量。在电泳结束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外灯下观察凝胶4转膜即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见各种尼龙膜性能及使用情况比较表。探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记。6预杂交（prehybridizafion）7Southern杂交转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA（探针DNA预先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。8洗膜取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：2×SSC/0.1%SDS，42℃，10min，1S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃10min，0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10min，0.1×SSC/0.1%SDS，56℃，10min。采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交还需注意的关键一步就是洗膜。在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。9放射性自显影检测（1）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）（2）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒（3）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）（4）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片2.2Northern杂交的主要过程 Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。1材料：待检测的RNA及制备好的探针。2设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。3试剂：(1)20×SSPE:175.3gNaCl,88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调pH至7.4,定溶到1L。(2)其他试剂：与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。4操作步骤：(1)RNA经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。(2)转移完毕后,以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。(4)用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42℃进行,应采用:50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's试剂，0.1%SDS；若于68℃进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt's试剂，0.1%SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。(5)在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108cpm/分·μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。(6)用1×SSC、0.1%SDS于室温洗膜20分钟,随后用0.2×SSC、0.1%SDS于68℃洗膜3次,每次20分钟。(7)用X光片(KodakXAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。[注意](1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟,部分水解。3.1Southern杂交的应用Southern杂交技术自产生以后得到了广泛的应用而且技术还在不断地完善和更新。在这里只是简要的介绍几种应用的领域。（1）Southern杂交在乙肝病毒检测中的应用[3]在此方法中先是将HBV的表达体进行表达，然后收集表达的DNA用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针，在与被检测的DNA进行Southern杂交最后完成后进行电泳曝光检查确定目标是否感染乙肝病毒。此方法能快速准确的检测出乙肝病毒非常实用。（2）Southern杂交检测乳腺癌骨髓微转移[4]在此方法中是应用肿瘤细胞特异或过量表达基因的检测。主要检测的是CK-19的特异性表达。对检测者去骨髓确保准确性，用CK-19作为探针来对骨髓进行Southern杂交在杂交完成进行点用实验，检测CK-19的特异性条带的存在。来作为判定的依据，此法比常规IHC法灵敏20倍能更早的检测出乳腺癌骨髓微转移，能提前做好预防和治疗。3.2Nouthern杂交的应用（1）Nouthern杂交在奶牛乳房炎抗性基因的帅选的应用[5]分别用高辛标记患乳房炎奶牛和健康奶牛外周血白细胞cDNA探针,对已构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库应用反向Northern斑点杂交技术进行差异筛选。最终确定哪些基因与奶牛乳房炎抗性有关。(2)Nouthern杂交在组织工程研究中的应用[6]组织培养后将目的探针与组织培养后的产物进行杂交，检测aggrecanmRNA的表达状况。在DNA杂交技诞生后为整个人类社会的发展做出了巨大的贡献，它迅速的运用于很多领域让人类在DNA分子层面上得到了长足的进步。我们可以发现任何一个科学技术的产生与发展都经过了很大的挫折，我们要能坚定自己的信念勇于追求才能有大的发展。所以我们在以后的生产实际中也要秉承这种信念才能获得成功。参考文献：[1]米志勇,柯灿,王丽霞.DNA杂交测序法[J].生物工程进,1996,16(3):54-56[2]李庆春.DNA杂交及其在实践中的应用[J].中学生物教学,2002,12:26[3]张秉强