第七章-第二节、微生物代谢与生长

第七章

第二节、微生物生长代谢生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加

生长指生物个体数目的增加

繁殖

在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常群体生长作为衡量微生物生长的指标。

群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程个体生长个体繁殖群体生长群体生长个体生长+个体繁殖由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况一、微生物纯培养的获得

平板划线分离法

稀释倒平板法

单孢子或单细胞分离法

利用选择性培养基分离法

富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加

二、微生物生长的测定评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；微生物生长微生物生长测量方法计数法重量法生理指标法1.计数法a.直接法利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；b.简接法原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。根据菌悬液的光吸收值能反映出细菌细胞浓度的原理，用浊度计或分光光度计测出细菌悬液的光吸收值，由此计算细菌的细胞数。C、比浊法2.重量法通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；3.生理指标测定法样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。三微生物的生长规律（一）、细菌群体生长规律

在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。生长曲线生长曲线可分：延滞期对数期衰亡期稳定期1.延滞期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：细菌不分裂，菌数不增加，但细胞内合成代谢活跃，胞内核酸、蛋白质的量均增加，细胞体积变大。影响迟缓期的因素：菌种、菌龄、接种量以及接种前后培养基成分的差异等。加入酶激活剂如Mg2+能缩短迟缓期。在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期：①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；②利用对数生长期的细胞作为“种子”；③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。2.对数期

特点：细菌数量呈对数增加；生长速度常数R最大；酶系活跃，细菌代谢旺盛；群体中的细胞化学组成及形态、生理特征一致，且细菌的形态、大小、染色性均典型，对外界环境因素的作用比较敏感。影响指数期微生物增代时间的因素菌种；营养成分；营养物的浓度发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度；实验室研究细菌生物学性状和做药敏试验选取用对数期细菌为佳（多数为8~18h培养的培养物）

特点：

1生长速率常数R等于02菌体产量达到了最高值

3合成次生代谢产物

4细菌形态和生理发生改变，细胞内出现储藏物质，芽孢菌内开始产生芽孢，G+菌可被染成G-菌。产生原因：

营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调，如碳氮比不合适有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）不合适通过补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等获得更多的代谢产物3.稳定期4.衰亡期特点：

1R为负值

2细胞的形态发生变化，出现畸形、菌体变长、肿胀或扭曲

3释放次生代谢产物，芽孢等

4菌体开始自溶产生原因：

生长条件的进一步恶化，有害代谢产物大量积累，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡研究细菌生长曲线的意义在无菌制剂和输液的制备时，为减少菌数的增加，要把灭菌工序放在迟缓期；在大量培养细菌时，选择适当的菌种、菌龄、培养基及控制培养条件，以缩短迟缓期；对数生长期的细菌生长繁殖快，代谢旺盛，利用此时期的细菌作为连续发酵的种子；实验室工作中，多采用对数期的细菌进行细菌形态结构、生理代谢等方面的研究。稳定期时细菌代谢产特增多并达到最大，发酵工业上，为获得更多的代谢产物如：氨基酸、抗生素等，适当补充营养物，延长稳定期；形成芽孢的细菌，选择衰退期作为保藏菌种。四、细菌的新陈代谢

新陈代谢：发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢（anabolism）的总和。 新陈代谢=分解代谢+合成代谢

分解代谢：指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和还原力的作用。

合成代谢：指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、ATP形式的能量和还原力一起合成复杂的大分子的过程。按物质转化方式分分解代谢：指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。合成代谢：是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程。在这个过程中要消耗能量。物质代谢：物质在体内转化的过程.能量代谢：伴随物质转化而发生的能量形式相互转化.按代谢产物在机体中作用不同分：初级代谢：提供能量、前体、结构物质等生命活动所必须的代谢物的代谢类型；产物：氨基酸、核苷酸等.次级代谢：在一定生长阶段出现非生命活动所必需的代谢类型；产物：抗生素、色素、激素、生物碱等（一）、微生物的能量代谢能量代谢是新陈代谢中的核心问题。中心任务：把外界环境中的各种初级能源转换成对一切生命活动都能使用的能源——ATP。

有机物最初能源 日光 通用能源 还原态无机物化能自养菌化能异养菌光能营养菌生物氧化的功能：产能(ATP)产还原力【H】小分子中间代谢物底物脱氢的途径

1、EMP途径

2、HMP3、ED4、TCAⅡ、递氢、受氢和ATP的产生★根据递氢特别是受氢过程中氢受体性质的不同,把微生物能量代谢分为呼吸作用和发酵作用两大类.发酵作用：没有任何外援的最终电子受体的生物氧化模式；呼吸作用：有外援的最终电子受体的生物氧化模式；★呼吸作用又可分为两类：

有氧呼吸——最终电子受体是分子氧O2;

无氧呼吸——最终电子受体是O2以外的无机氧化物，如NO3-、SO42-等.概念:是以分子氧作为最终电子(或氢)受体的氧化过程；是最普遍、最重要的生物氧化方式。途径：EMP,TCA循环特点：必须指出，在有氧呼吸作用中，底物的氧化作用不与氧的还原作用直接偶联，而是底物在氧化过程中释放的电子先通过电子传递链（由各种电子传递体，如NAD,FAD,辅酶Q和各种细胞色素组成）最后才传递到氧。1、有氧呼吸2、无氧呼吸某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸；无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2等无机物，或延胡索酸（fumarate）等有机物。由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，所以生成的能量不如有氧呼吸产生的多。☆概念：在生物氧化中发酵是指无氧条件下，底物脱氢后所产生的还原力不经过呼吸链传递而直接交给一内源氧化性中间代谢产物的一类低效产能反应。在发酵工业上，发酵是指任何利用厌氧或好氧微生物来生产有用代谢产物的一类生产方式。☆发酵途径：葡萄糖在厌氧条件下分解葡萄糖的产能途径主要有EMP、HMP、ED和PK途径。3、发酵作用五、微生物的代谢调控微生物代谢过程中的自我调节酶活性的调节酶合成的调节☆微生物自我调节代谢的方式1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞如：只有当速效碳源或氮源耗尽时，微生物才合成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶系统。2.通过酶的定位控制酶与底物的接触3.控制代谢物流向:

（一）、酶活性的调节通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率的方式。是酶分子水平上的调节，属于精细的调节。（一）调节方式：包括两个方面：1、酶活性的激活：在代谢途径中后面的反应可被较前面的反应产物所促进的现象；常见于分解代谢途径。如：粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进2、酶活性的抑制：包括：竞争性抑制和反馈抑制。概念：反馈：指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。

凡使反应速度加快的称正反馈；凡使反应速度减慢的称负反馈（反馈抑制）；反馈抑制——主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除1.直线式代谢途径中的反馈抑制： 苏氨酸脱氨酶苏氨酸 α-酮丁酸 异亮氨酸 反馈抑制 其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成2.分支代谢途径中的反馈抑制：在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。主要有：同功酶的调节，顺序反馈，协同反馈，积累反馈调节等。（二）反馈抑制的类型（1）、同功酶调节——isoenzyme定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的一组酶。意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。———某一产物过量仅抑制相应酶活，对其他产物没影响。举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节（2）、协同反馈抑制定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum） 多粘芽孢杆菌（Bacilluspolymyxa） 天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。（3）、合作反馈抑制定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和10%。（4）积累反馈抑制定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。Try16%CTP14%氨甲酰磷酸

13%AMP41%……积累反馈抑制——E.coli谷氨酰胺合成酶的调节（5）顺序反馈抑制一种终产物的积累,导致前一中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节（三）、酶活力调节的机制变构酶理论：变构酶为一种变构蛋白，酶分子空间构象的变化影响酶活。其上具有两个以上立体专一性不同的接受部位，一个是活性中心，另一个是调节中心。活性位点:与底物结合变构位点:与抑制剂结合,构象变化,不能与底物结合与激活剂结合,构象变化,促进与底物结合

变构酶（四）、酶合成的调节通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，是基因水平上的调节，属于粗放的调节，间接而缓慢。1.诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。微生物通过诱导作用而产生的酶称为诱导酶（为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的酶类）。

举例：E.coli在含乳糖的培养基中合成β-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶等。诱导物(inducer)：底物或结构类似物，如：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）；

★诱导作用的类型：同时诱导：诱导物加入后，微生物能同时诱导出几种酶的合成，主要存在于短的代谢途径中。顺序诱导：先合成能分解底物的酶，再合成分解各中间代谢物的酶达到对复杂代谢途径的分段调节。组成酶（固有酶）：不依赖底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：EMP途径的一些酶。诱导酶：依赖于底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。

是阻碍代谢过程中包括关键酶在内的一系列酶的合成的现象，从而更彻底地控制和减少末端产物的合成。①末端产物阻遏（end-productrepression）：由于终产物的过量积累而导致生物合成途径中酶合成的阻遏的现象，常常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等这些重要产物生物合成的时候。例如过量的精氨酸阻遏了参与合成精氨酸的许多酶的合成。2.阻遏（repression）②分解代谢物阻遏（cataboliterepression）：当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时,故又称葡萄糖效应。分解代谢物阻遏导致出现“二次生长（diauxicgrowth）”.直接作用者是优先利用的碳源的中间代谢物——实质是：因代谢反应链中某些中间代谢物或末端代谢物的过量积累而阻遏代谢中一些酶的合成的现象。

二次生长：细菌对不同营养物质的利用能力是不同的，有的可以直接被利用，如葡萄糖或NH4+，有的需要过一段时间才能被吸收利用，如乳糖或鱼粉等。当培养基中同时含有两类碳源或氮源时，细菌生在生长过程中就会出现二次生长现象。（五）、代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段：

改变微生物遗传特性(遗传学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；改变细胞膜透性；（1）对于直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物

AaBbCcDdE

（1）营养缺陷型菌株的应用

末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物C。1.遗传学方法（2）、抗反馈控制突变株的应用★抗反馈控制突变株——是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。★抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株和营养缺陷性回复突变株中获得。★获得方法及其原理：目标产