第七章-发酵过程控制

研究菌体的培养规律、外界控制因素

对过程影响及如何优化条件，达到最佳效果是发酵工程的重要任务。第七章发酵过程控制

发酵过程中的代谢变化与控制参数

温度对发酵的影响及其控制

pH值对发酵的影响及其控制

溶解氧对发酵的影响及其控制

菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制CO2和呼吸商补料的控制泡沫对发酵的影响及其控制

对于产物形成而言，代谢变化就是反映发酵过程中的菌体生长、发酵参数的变化和产物形成速率三者之间的关系。

微生物的代谢产物，按其与菌体生长、繁殖的关系来说，又分为初级代谢产物（primatymetabolite)和次级代谢产物（secondarymetabolite)第一节发酵过程中的代谢变化与控制参数初级代谢产物一、菌体合成代谢产物次级代谢产物（一）初级代谢产物；微生物产生、生长、和繁殖所必须的物质，如蛋白质、核酸、氨基酸、等。（二）次级代谢产物：由微生物产生，与微生物生长、繁殖无关的一类物质，抗生素是其中一大类，还有生物碱和微生物毒素。代谢变化分菌体生长、产物合成、菌体自溶。一、初级代谢的变化

二、次级代谢的变化

三、发酵过程的主要控制参数

初级代谢变化的根本原因在于菌体的代谢活动引起环境的变化，而环境的变化又反过来影响菌体的代谢。

在初级代谢中，菌体生长仍显示适应期、对数生长期、静止期和衰亡期的特征。由于菌体的生理状态与培养条件不同，各个时期时间长短也不尽相同，且与接种微生物的生理状态有关。工业发酵中往往要接入处于对数生长期的菌体，以尽量缩短适应期。

基质浓度的变化一般随发酵时间的延长而不断下降。

溶解氧浓度亦随发酵过程的变化而发生变化。

初级代谢产物由于没有明显的产物形成期，所以它是随菌体生长在不断地形成。次级代谢产物包括大多数的抗生素、生物碱和微生物毒素等物质。属非偶联型，次级代谢产物的变化一般分为：

菌体生长阶段产物合成阶段菌体自溶阶段

在这个过程中，碳源和氮源等进行分解代谢，菌体进行合成代谢。

碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，浓度明显降低。

随着新菌体不断合成，菌体浓度明显增加，摄氧速率也不断增大，溶解氧浓度不断下降。

pH值随基质代谢的变化，也发生一定的改变。

此期间，产物的产量逐渐增加，直至达到高峰，生产速率也达到最大，直至产物合成能力衰退。

此阶段，产生菌的呼吸强度一般无显著变化。

这个阶段的代谢变化是以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主。此时，碳源、氮源和磷酸盐等的浓度必须控制在一定范围内，并严格控制发酵条件。贮藏期：细胞积累脂肪和糖的过程，使细胞干重增加，开始形成产物。持续期：细胞干重不变，但继续耗糖和分泌产物。

此阶段，菌体衰老，细胞开始自溶，氮含量增加，pH之上升，产物合成能力衰退，生产速率下降。三、发酵过程主要控制参数

（一）物理参数温度、压力、搅拌转数、搅拌功率、空气流量、黏度、浊度。（二）化学参数

pH、基质浓度、溶解氧浓度、氧化还原电位、产物浓度、废气中氧及CO2的浓度、（三）生物参数菌丝形态、菌体浓度

除上述外，还有跟踪细胞生物活性的其它化学参数，如NAD-NADH体系、ATP-ADP-AMP体系、DNA、RNA、生物合成的关键酶等，需要时可查有关资料。

pH值：发酵液的pH值是发酵过程中各种生化反应的综合结果，它的高低与菌体生长和产物合成有着重要关系。

温度：它的高低与发酵液中的酶反应速度、氧在培养液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率以及产物合成速率密切相关。

溶解氧浓度：利用溶解氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，也可作为发酵中间控制的参数及设备供氧能力的指标。

基质含量：它是发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。它的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制指标。压力：发酵过程中罐内维持一定的正压可防止杂菌污染，保证纯种培养，间接影响菌体代谢，一般维持（0.2~0.5）×105Pa。罐压的高低还与氧和CO2在培养液中的溶解度有关

搅拌转速：它的大小在一定程度上与发酵液中氧的传递速率和发酵液的均匀性有关。

在发酵的不同阶段控制不同的转数，以调节培养基中的溶氧。它的大小与氧在发酵液中的传递速率和发酵液的均匀性有关。

搅拌功率：与氧的容量传递系数有关

空气流量：每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，一般控制在0.5~1.0(m3/L·min)。

黏度：可作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况

浊度：能及时反映单细胞生长状况的参数。

料液流量：控制流体进料的参数。

产物的浓度：衡量发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数氧化还原电位：是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。

废气中的氧含量：由废气中氧和CO2含量可算出产生菌的摄氧率、呼吸商和发酵罐的供氧能力。废气中的CO2的含量：计算产生菌呼吸商，了解产生菌呼吸代谢规律。菌体形态：一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一菌体浓度：是控制微生物发酵的重要指标第二节温度对发酵的影响1.对各种酶反应速率影响2.改变菌体代谢产物的合成方向3.影响微生物代谢控制机制4.影响发酵液理化性质5.影响发酵的动力学和产物的生物合成生物热搅拌热影响因素蒸发热辐射热一、温度对发酵的影响二、影响发酵温度变化的因素三、温度的控制

影响各种酶的反应速率和蛋白质性质•影响发酵液的物理性质•影响生物合成的方向。

–例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。发酵过程，微生物生长速率变化

dX/dt=μX-αXμ:比生长速率;α：比死亡速率当处于生长状态时，μ>>α,α可忽略。μ与α与温度有关根据Arrenhnius公式μ=Ae-E/RTα=A’e-E’/RT通常E’大于E，所以α比μ对温度变化更为敏感。例：青霉菌生产青霉素青霉菌生长活化能E=34kJ/mol;青霉素合成活化能=112kJ/mol

青霉素合成速率对温度较敏感，温度控制相当重要。Q发酵=Q生物

+Q搅拌

–Q蒸发

–Q辐射发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。Q生物：生物热是生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为CO2,NH3时释放出的大量能量。

用途：合成高能化合物，供微生物生命代谢活动热能散发影响生物热的因素：生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应关系。一般而言，同一菌种，在同一条件下，培养基成分越丰富，营养被利用的速度越快，产生的生物热就越大。生物热的大小随培养时间的不同而不同。实验发现抗生素高产量批号的生物热高于低产量批号的生物热。说明抗生素合成时微生物的新陈代谢十分旺盛。生物热的大小与菌体的呼吸强度有对应关系，呼吸强度越大，所产生的生物热也越大。在四环素发酵中，还发现生物热和菌的呼吸强度的变化有对应关系，特别是在80小时以前。从此实验中还可看到，当产生的生物热达到高峰时，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生物热的大小。Q搅拌：通风发酵都有大功率搅拌,搅拌器转动引起的液体之间及液体与设备之间的摩擦所产生的热量。Q搅拌=()3600PVP/V：通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率，kW/m33600：热功当量，kJ/(kW∙h)Q蒸发:通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控制条件的不同而有所变化。空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。同时必然会引起水分的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。•蒸发热的计算：

Q蒸发=G（I2-I1）

G：空气流量，按干重计算，kg/hI1

、I2

：进出发酵罐的空气的热焓量，J/kg（干空气）•辐射热：由于发酵罐内外温度差，通过罐体向外辐射的热量。•辐射热可通过罐内外的温差求得，一般不超过发酵热的5%。发酵热的测定（1）通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热。（2）通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置测得温度随时间上升的速率S，按下式可求得发酵热：最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。最适发酵温度随着微生物菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段的不同而不同。

最适发酵温度的选择:–在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一定好。–温度的选择要参考其它发酵条件。–温度的选择还应考虑培养基成分和浓度

在菌体的生长阶段，应选择最适生长温度；在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。

温度的控制：工业生产上通常将冷却水（或冷媒）通入发酵罐夹层或蛇形管或热交换设备中，通过热交换来降温，以维持最适温度。发酵罐：夹套（10M3以下）盘管（蛇管）（10M3以上）第三节pH对发酵影响及控制•

发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数。它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。因此，必须掌握发酵过程中pH的变化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态。

尽管多数微生物能在3-4个pH单位的pH范围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在很窄的范围内保持恒定。pH值对发酵的影响发酵过程中pH值的变化发酵pH值的确定及控制pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响•pH影响酶的活性•pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态•pH影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解•pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；

H+或OH-在细胞内改变了胞内原有的中性状态，影响到酶蛋白的解离度和电荷情况，从而改变酶的结构和功能。

影响微生物原生质膜所带电荷的状态。改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄。影响培养基中某些组分的解离，进而影响到微生物对这些成分的吸收。

不同的pH值，往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。

pH值对产物的稳定性也有影响发酵过程中，pH值的变化，取决于所使用的菌种、培养基成分和培养条件的不同而发生变化。发酵过程中，随着微生物对培养基中营养物质的利用及某些物质的积累，发酵液的pH值会发生一定的变化。微生物的自溶，引起发酵液中氨基酸等的增加，会使pH值增加。发酵所用的碳源种类不同，pH值变化也不一样。凡是发酵过程中，碱性物质的消耗和酸性物质的生成或释放都会引起发酵液中pH值下降。引起pH值下降的主要原因培养基中C/N比例不当，碳源过多，尤其是葡萄糖或中间补糖过多，加之溶解氧不足，致使大量有机酸积累，引起pH值下降。消泡油加的过多。生理酸性物质的存在，氨被利用，使pH值下降。引起发酵液pH值上升的主要原因C/N比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使pH值上升。生理碱性物质的存在。中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加入过多，使pH值上升。

三、发酵pH值的确定和控制

原则：有利于菌体生长和产物的合成。一般根据实验结果确定。

大多数细菌生长的pH

值为6.3-7.5，霉菌和酵母菌为3-6，放线菌为7-8．微生物发酵的pH值随菌种和产品的不同而不同。同一菌种，其生长得最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。

最适pH与菌株，培养基组成，发酵工艺有关。应按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围。在确定发酵适宜的pH值时，应考虑培养温度对它的影响。μQPμQPμQPμQPpH值比生长速率比生产速率最适pH与微生物生长，产物形成之间相互关系有四种类型：最适pH与微生物生长，产物形成之间相互关系有四种类型：菌体比生长速率μ和产物比生产速率QP的最适pH在一个相似的较宽的范围内（比较容易控制）；

μ较宽，Qp范围较窄，或μ较窄，Qp范围较宽（难控制，应严格控制）；

μ和Qp对pH都很敏感，其最适pH相同（应严格控制）；更复杂，μ和Qp对pH都很敏感，并有各自的最适pH（难度最大）；pH值调节、控制的主要方法调节基础培养基的配方选择合适的培养基，调节培养基原始的pH值，添加缓冲剂。考虑发酵培养基的基础配方，使之有适当的比例，使发酵过程pH

的变化在适合的范围内。在分批发酵中常用CaCO3作为缓冲剂来控制pH值的变化。补料控制补酸/补碱：硫酸铵、氨水可在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH制的调节，如果此法不能改善发酵情况，应采用补料的方法。补加碳源或氮源补加生理酸性物质[如（NH4)2SO2]或生理碱性物质，可以调节pH值、补充营养物质、增加培养液浓度和减少阻遏作用。当发酵液的pH值较高及氨氮含量又较低的时候，可加入生理酸性铵盐调节；当发酵液的pH值和氨氮含量都很低时，可补加氨水（浓度20%左右）应采用少量多次流加的方法进行。第四节溶解氧对发酵的影响及控制溶解氧控制（供氧和需氧两方面）1.供氧方面：调节转速或通气速率控制2.发酵液需氧方面：受菌体浓度、基质的种类和浓度培养条件影响，可通过控制补料速度、补水，加表面活性剂、调温来控制。溶解氧对发酵的影响供氧与微生物代谢的关系发酵过程溶解氧的变化溶解氧浓度的控制大多数发酵过程是好氧的，因此需要供氧。如果考虑呼吸的化学计量，则葡萄糖的氧化可由下式表示：

C6H12O6十6O2＝6H2O十6CO2

只有当这两种反应物均溶于水后，才对菌体有用。氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右(氧在水中的饱和度约为l0mg/L)。许多发酵的生产能力受到氧利用限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。培养基的成分和浓度显著影响耗氧：培养液营养丰富，菌体生长快耗氧量大；发酵醪浓度高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随之增大。菌龄影响耗氧：菌体呼吸旺盛时，耗氧量大；发酵后期，耗氧量减少。影响耗氧的主要因素溶解氧对发酵的影响发酵条件影响耗氧：在最适宜的条件下发酵，耗氧量大。发酵过程中，有毒代谢产物如CO2、挥发性的有机酸和过量的氨的排出，有利于提高菌体的摄氧量。氧是一种难溶于水的气体。在25℃，1×105Pa条件下，纯氧在水中的溶解度为1.26mmol/L，空气中的氧在纯水中的溶解度更低（0.25mmol/L）。在28℃氧在发酵液中的溶解度只有0.22mmol/L，而发酵液中的大量微生物耗氧迅速（耗氧速率大于25~100mmol/L.h），因此，供氧对于好氧微生物来说是非常重要的。在对数生长期，即使发酵液被空气饱和，若此时停止供氧，发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗尽。

在好氧深层培养中，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。

好氧微生物的生长和代谢活动都需要消耗氧气，它们只有在氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用。液体中的微生物只能利用溶解氧，气液界面处的微生物还能利用气相中的氧。强化气液界面也将有利于供氧。在微生物的培养过程中，应保持供氧与耗氧的平衡，满足微生物对氧的利用。（1）临界氧发酵生产中用空气饱和度百分数来表示溶氧浓度。这只能在相似的条件下，在同样的温度、罐压、通气搅拌下进行比较。这种方法能反映菌的生理代谢变化和对产物合成的影响。临界氧：不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度，如对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。

临界溶氧浓度：满足微生物呼吸的最低氧浓度。在临界氧浓度下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度的降低而显著下降。

当不存在其他限制性因素时，溶解氧浓度高于临界值时，细胞的比耗氧速率保持恒定

。如果溶解氧浓度低于临界值，细胞的比耗氧速率，就会大大降低，细胞处于半厌气状态。溶氧对发酵的影响只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量。如果溶氧浓度低于临界值，则菌体代谢受到干扰。但是，发酵工业的目标是要得到菌体发酵的产物而不是菌体本身。因此，由氧饥饿而引起的细胞代谢干扰，可能对形成某些产物是有利的；同理，当提供的氧浓度远大于临界值时，虽对菌体形成无妨，但也许能刺激产物的形成；所以，某种产物形成的最佳条件可能不同于菌体生长的最佳通气条件。最适氧浓度与菌体合成和产物的合成代谢的特性有关。根据需氧不同，可将初级代谢发酵分为：a.供氧充足条件下，产量最大；若供氧不足，合成受强烈抑制；如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等b.供氧充足条件下，可得最高产量；若供氧受限，产量受影响不明显；如：异亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸等c.若供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才获得最大量产物；若供氧充足，产物形成反而受抑制；如：亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸等但在实际生产过程中需注意：–溶解氧浓度过低（代谢异常，产量降低）–溶解氧浓度过高（代谢异常，菌体提前自溶）这就决定了大多数微生物深层培养需要适当的通气条件，才能维持一定的生产水平。实际上，生物氧化中氧吸收的效率多数低于2%，通常情况下常常低于1%。也就是说，通入发酵罐约99%的无菌空气被白白浪费掉了。而且大量无用空气还是引起过多泡沫的因素。所以通气效率的改进可减少空气的使用量，从而减少泡沫的形成和杂菌污染的机会。★呼吸临界氧值可用尾气O2含量变化和通气量测定，也可用溶氧电极测定。各种微生物的临界氧值：

细菌和酵母：3~10%放线菌：5~30%霉菌：10~15%★合成的临界氧值：考察不同溶氧浓度对生产的影响，便可求得合成的临界氧值。注意：

●实际上，呼吸临界氧值不一定与产物合成临界氧值相同。

●生物合成临界氧浓度并不等于其最适氧浓度。

●在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。过高的溶氧对生长可能不利。一般对于好氧微生物：CCr:＝0.003~0.05mmol/l（约是饱和浓度1～25%）例：酵母CCr:＝4.6*10-3mmol.L-1,1.8%产黄青霉CCr:＝2.2*10-2mmol.L-1,8.8%二、供氧与微生物代谢的关系呼吸强度：单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧的量（QO2，

mmol/（g干菌体·h））。耗氧速率：单位体积培养液，在单位时间内的吸氧量（r，mmolO2/h·L）。需氧方面溶氧的控制微生物的“需氧”可用耗氧速率或呼吸强度来表示式中，r——摄氧率，mmolO2/(L·h)；

QO2——呼吸强度，mmolO2/(g菌·h)；

X——菌浓，g/L。若发酵液中溶氧保持不变，即供氧=需氧，则使供需失去平衡的因子也会改变溶氧浓度。r取决于微生物的呼吸强度和单位体积菌体浓度。发酵过程中，供氧的多少应根据不同的菌种、发酵条件和发酵阶段等具体情况决定。耗氧速率发酵过程溶解氧的变化发酵前期，需氧量不断增加，此时需氧量超过供氧量，使溶解氧明显下降，摄氧率同时出现一个高峰。发酵中后期，分批发酵溶解氧变化较小，如不补加基质，发酵液的摄氧率与菌体的呼吸强度变化不大，供氧能力保持不变，溶解氧浓度变化也不大。生产后期，呼吸强度减弱，溶解氧浓度也会逐步上升。当外界进行补料时，则溶解氧浓度就会发生变化，如补糖后，发酵液的摄氧率就会增加，引起溶解氧浓度下降，经过一段时间后又会逐步回升。引起溶解氧异常下降的主要原因污染好气性杂菌。菌体代谢发生异常，需氧量增加，使溶解氧下降。某些设备或工艺控制发生故障或变化，可能引起溶解氧下降。如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢；消泡剂加入过多影响供氧的工艺操作如停止搅拌、闷罐等。引起溶解氧异常升高的原因在供氧条件没有发生变化的情况下，主要是耗氧发生改变所致，如菌体代谢出现异常、耗氧能力下降污染了烈性噬菌体，影响尤为突出。溶氧监测的作用（1）从发酵液中的溶解氧浓度变化，可以了解微生物生长代谢是否异常（2）工艺控制是否合理（3）设备供氧能力是否充足。

供氧方面：气相中的氧先溶解在培养液内，然后传递到细胞内呼吸酶的位置上才能被利用。这一系列过程需经过各种阻力。即气体中的氧通过气膜阻力、气液界面阻力、液膜阻力而扩散到液体内部。空气中的氧液体中的溶氧微生物体内的氧。

p

传氧方向

液相主流气相主流

ci

pi

c界面

在氧传递过程中液膜阻力是控制因素。

气膜液膜溶解氧浓度的控制供氧方面

OTR=kLα(c*-cL)=(QO2)mcLc(X)Ko+cL

设法提高氧传递的推动力，如增加罐压、采用富氧通气操作。

提高液相体积氧传递系数kLα，如调节搅拌转速或通气速率，或改变发酵液的流动状态等。单位接触界面氧的传递速率影响KLa（溶氧系数）的因素

1、搅拌：（1）增加气液接触面积（打碎气泡），增加氧传递面积。（2）使液体形成涡流，从而延长气泡在液体中的停留时间。（3）增加液体的湍流程度，降低气泡周围的液膜阻力、液体主流中液体阻力、从而增加KLa值。（4）减少菌丝结团，降低细胞壁表面的液膜阻力。改善细胞对氧和营养物质的吸收，同时降低细胞周围的“废物”和“废气“的浓度，有利于微生物代谢。

2、空气的流速

KLa随空气速度的增加而增大，但空气速度过大，则可使叶轮发生过载需氧方面发酵液的需氧量受菌体浓度、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响。发酵液的摄氧速率随菌体浓度的增加而按比例增加。氧的传递速率是随菌体浓度的对数关系减少。控制补料速度，使微生物菌体浓度维持在最适范围内，是控制最适溶氧浓度的重要方法。调节温度液化培养基中间补水添加表面活性剂3、培养液的物理性质发酵液的表面张力、黏度、离子浓度等都会影响气体的溶解度，还影响液体的湍动以及界面和液膜的阻力，因而影响传递效率。发酵液中菌丝浓度增大，表观黏度增大，通气效率下降。发酵过程中添加糖、花生饼粉等营养物质、前体或无菌水、消泡剂等均可改变培养液的理化性质。

4、空气分布器对通气效率的影响发酵罐中装有多孔分布器和单孔分布器，在气流速度很低时，多孔分布器有较高的通气效率。但两者的区别随着气流速度的增加而逐渐减少。可能是低气流时多孔分布器可形成更大的传递面积，而当通气量增大时，单孔分布器能更大的增加发酵液的湍动程度。5、流加H2O2对提高供氧

传统的方法是给发酵罐通入无菌空气，达到供氧，近年来，加入氧载体、流加H2O2

与藻类共培养以及通过基因克隆转入带氧的基因等方法。采用H2O2

供氧的优点：

H2O2与通气供氧结合，控制流加浓度和流加方式可提高发酵体系的细胞密度；

H2O2可在过氧化酶的催化下分解放出氧气，在反应不是非常强烈的条件下，氧气将直接以分子形式传给细胞，不会形成气液传质阻力，提高氧的传质速率；采用H2O2

供氧存在的问题：

对剪切力敏感及非常黏稠的发酵体系提供了一种供氧手段；

H2O2

供氧还可以改变菌体的代谢途径，促使菌体利用更有效的代谢途径来合成产物。

H2O2

供对细胞有害，H2O2本身在一定浓度对细胞有损害作用，更多的是由于H2O2在过氧化氢酶的催化作用下，可以分解形成一些自由基、超氧阴离子，羟基自由基、原子氧等，它们会阻碍ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质的生物合成。可通过优化H2O2的流加浓度、选择流加方式等手段来解决。控制溶氧的工艺手段（1）改变通气速率（增大通风量）：增大KLa值。注意，过分增大通气速率会产生副作用，如泡沫生成、罐温增高等。（2）改变搅拌速度：转速较低时，增大搅拌速度对提高溶氧浓度有明显作用；当转速很高时，再增大搅拌速度起不到调节作用，反而打碎菌丝体，使菌体自溶并减少产量。（3）改变气体组成中的氧分压（4）改变罐压：提高C*。不是十分有效（5）改变发酵液的理化性质：如加消沫剂、补加无菌水、改变培养基的成分等（6）加入传氧中间介质：一般是不溶于培养液的液体，呈乳化状态来提高气液相之间的传递。传氧中间介质有：血红蛋白、烃类碳氢化合物（煤油、石蜡等）、含氟碳化物。本节思考题

•1、临界溶氧浓度？•2、发酵过程中，引起溶氧异常改变的可能原因？菌体浓度对发酵的影响及控制基质对发酵的影响及其控制第五节菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制菌体浓度(cellconcentration)是指单位体积培养液中菌体的含量。菌体浓度的大小，在一定条件下不仅反映了菌体细胞的多少，而且反映了菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段。一、菌体浓度对发酵的影响菌体浓度的大小与菌体生长速率密切相关，比生长速率大的菌体，菌浓增长迅速，反之就缓慢。菌浓的增长与营养物质和环境条件密切相关。Ks：饱和常数，生长速率一半时的底物浓度生长速率取决于基质浓度当c(S)＞10KS时，µ≈µm。c(S)＜＜KS，菌体的比生长速率随基质浓度的增加而增加。基质过浓，导致抑制会引起比生长速率下降。µc(S)=µmKs+c(S)菌浓的高低，对发酵产物的得率有着至关重要的影响，在适宜的比生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比例关系，即：

P=(QP)mc(X)但菌浓过高，可能会改变菌体的代谢途径，对溶解氧的影响尤为突出。随着菌体浓度的增加，培养液的摄氧率按比例增加，表观黏度也随之增加，流体的性质亦发生改变，使氧的传递速率成对数减少。r=QO2c(X)当OUR>OTR，溶解氧减少，并成为限制性因素时，随之会给发酵带来各种影响。如代谢途径的改变，酵母生长停滞；抗生素发酵中，使产量下降等。摄氧率OUR=耗氧速率r

：指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，发酵过程中取决于微生物的呼吸强度QO2和单位体积菌体浓度。确定基础培养基的适当比例，以避免菌体浓度过浓（或过稀）。通过中间补料控制菌体的生长，当菌体生长缓慢，菌体浓度过低时，可补加部分磷酸盐，以促进其生长。可利用菌体代谢产生的CO2的量来控制生产过程的补糖。菌浓控制碳源对发酵的影响及其控制氮源的种类和浓度对发酵的影响及其控制磷酸盐浓度对发酵的影响及其控制迅速利用碳源：能较快地参与代谢，合成菌体和产生能量，并产生分解产物，有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用。缓慢利用碳源：被菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于抗生素的分泌期，为许多微生物药物发酵所利用。碳源浓度对菌体代谢、产物的形成及氧的传递都会产生影响。浓度过大，导致菌体异常繁殖。如产生阻遏作用的碳源用量过大，产物的合成会受到明显的抑制。若仅仅提供维持量的碳源，菌体的生长和产物合成都会停止。碳源组成：在工业上，发酵培养基中常采用含迅速和缓慢利用的混合碳源发酵过程中控制碳源的浓度，可采用经验法和动力学法，即通过中间补料的方法来控制。这主要是根据不同的代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式。不同种类和不同浓度的氮源都会影响产物的合成方向和产量。快速利用氮源易被菌体利用，可促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，尤其是对某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。氮源对发酵的影响和控制缓慢利用氮源对延长次级代谢产物的分泌期，提高产物的产量是有益的，但不可一次全部投入。选择适当的氮源和适当的浓度。发酵培养基选用含有快速利用和缓慢利用的混合氮源。发酵过程中补加氮源补加有机氮：根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮（如酵母粉、玉米浆、尿素等）。补加无机氮源：补加氨水或硫酸铵。有机氮磷是菌体生长繁殖和合成代谢产物所必需的成分。微生物生长良好所必需的磷酸盐浓度0.32~300mmol/L，但对于次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol/L。3、磷酸盐浓度的影响和控制磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。在发酵过程中，有时会出现代谢缓慢的情况，可补加磷酸盐改善。CO2对菌体生长和产物形成的影响排气中CO2浓度与菌体量、pH值、排气氧之间的关系呼吸商与发酵的关系CO2浓度的控制第六节CO2和呼吸商CO2往往对菌体生长有直接的影响。•CO2是呼吸和分解代谢的终产物，也可作为重要的基质。•CO2对生产过程具有抑制或刺激作用。•CO2影响代谢产物的合成。

当排出的CO2浓度高于4%时，碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降；基质的异化（或分解代谢）和ATP的生成也将受到阻碍，从而影响产物的合成。•CO2影响细胞膜的结构，从而影响膜的运输。一、CO2对菌体生长和产物形成的影响细胞膜脂质相中浓度达临界值时，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，导致许多基质的膜运输受阻，影响细胞膜的运输效率，使细胞处于麻醉状态，细胞生长受抑制，形态改变。CO2影响细胞膜的结构，从而影响膜的运输菌体生长的检测

补糖与排气CO2、pH值变化的关系二、排气中CO2浓度与菌体量、pH值、排气氧之间的关系连续测定排气氧和CO2浓度，可计算出发酵过程中二氧化碳的释放率。CRR(carbondioxidereleaseradio二氧化碳释放率)CRR=QCO2c(X)=F进V[]C惰进·CCO2出1-(CO2出+CCO2出)-CCO2进fQCO2比二氧化碳释放率，molCO2/(g菌·h)c(X)菌体干重，g/LF进进气流量C惰进、CCO2进分别为排气中惰性气体、二氧化碳的体积百分数CCO2出、CO2出分别为排气中二氧化碳、氧的体积分数V发酵液的体积，Lf=273273+t进×P进t进进气温度，℃P进进气绝对压强，Pa通过测定排气中CO2浓度的变化，采用控制流加基质的方法，来实现对菌体的生长速率和菌体量的控制。发酵液中补加葡萄糖，排气中CO2浓度增加，pH值下降。其原因有二：其一是因为葡萄糖被菌体利用产生CO2，其中溶解于培养液中的CO2使培养液的pH值下降。其二是因为葡萄糖被利用的过程中，产生有机酸，使pH值下降。2、补糖与排气CO2，pH值变化的关系由于糖、CO2、pH值三者之间的相关性，所以测定CO2释放率来控制补糖速率。发酵过程耗氧速率(oxygenuptakerate，简称OUR单位molO2/(h·L))OUR=QO2c(X)=F进V[CO2进-]C惰进CO2出1-(CCO2出+CO2出)fQO2呼吸强度，molO2/(g·h)RQ=CRROUR三、呼吸商与发酵的关系呼吸商可以反映菌体的代谢情况，是碳-能源代谢情况的指示值。在碳-能源限制及供氧充分的情况下，碳-能源趋于完全氧化。

菌体在不同的基质中，RQ也不同。在抗生素发酵中，菌体在不同的阶段其RQ值也不一样。在实际生产中测得的RQ值明显低于理论值，说明发酵过程中存在着不完全氧化的中间代谢物和葡萄糖以外的碳源。如发酵过程中加入消泡剂。四、CO2浓度的控制

CO2的溶解度随压力的增加而增加。

CO2浓度的控制应随它对发酵的影响而定。如果CO2对产物合成有抑制作用，则应设法降低其浓度；若有促进作用，则应提高其浓度。改变搅拌和通气速率的大小在发酵罐中不断通入空气，既可保持溶解氧在临界点以上，又可随废气排出所产生的CO2，使之低于产生抑制作用的浓度。

降低通风量，有利于增加CO2在发酵液中的浓度；反之则会减小CO2浓度。

调节罐压，将影响到CO2的浓度，同时对菌体代谢和其他参数也会产生影响补料分批培养（fed-batchculture，简称FBC）的作用补料的方式及控制第七节补料的控制可控制抑制性底物的浓度。可以解除或减弱分解代谢物的阻遏。可以使发酵过程最佳化。一、FBC的作用：已有研究结果表明，FBC对微生物发酵有下列几个基本作用：二、补料的方式及控制

•补料的方式：•连续流加、不连续流加、多周期流加•快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加•单组份流加、多组份流加•为改善发酵培养基的营养条件和去除部分发酵产物，FBC还采用“放料和补料”（withdrawandfill）方法。流加操作控制系统反馈控制无反馈控制依据控制指标的不同直接方法间接方法间接法是以溶解氧、pH值、呼吸商、排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制参数。选择与过程直接相关的可检参数作为控制指标。对于通气发酵，利用排气中CO2含量作为FBC作为反馈控制参数。它是依靠精确测量CO2的逸出速度和葡萄糖的流动速度，达到控制菌体的比生长速率和菌浓。pH值也可用作糖的流加控制参数。泡沫的形成及其对发酵的影响泡沫的消除第八节泡沫对发酵的影响及其控制一、泡沫产生及其对发酵的影响1、通气搅拌的强烈程度由外界引进的气流被机械地分散形成；通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。（一）发酵过程泡沫产生的原因2、培养基配比与原料组成

培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、黄豆饼干粉、酵母粉和糖蜜等是主要的发泡物质。培养基中蛋白质含量越多，发酵液的黏度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久稳定。发酵液中糖、蛋白质和代谢物等的存在起到加强或稳定泡沫的作用。3、菌种、种子质量和接种量菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量。4、灭菌质量

糖蜜培养基的灭菌温度从110度升高到130度，灭菌时间为半小时，发泡系数几乎增加一倍。由发酵过程产生的气体聚结生成的发酵泡沫（二）起泡的危害1、降低生产能力

在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量。2、影响菌的呼吸如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。3、引起染菌由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。4、引起原料浪费5、消泡剂的加入有时会影响发酵或给提炼带来麻烦使发酵罐的装填系数减少造成大量逃液，导致产物的损失泡沫“顶罐”，从排气管路或轴封逃出增加了染菌的机会影响通风搅拌，妨碍了微生物的呼吸，造成发酵异常影响了微生物群体的效果，增加了微生物群体的非均一性发酵时起泡的方式发酵过程中，泡沫保持恒定。发酵早期，起泡后稳定的下降，以后保持恒定。发酵前期，泡沫稍微降低后又开始回升。发酵开始起泡能力低，以后上升。综合方式

调整培养基中的成