pH响应氟化嵌段聚合物的应用

引言1.1肿瘤治疗概述癌症，又称恶性肿瘤，是由细胞恶性生长引发的疾病。由于其生长迅速、易扩散的特点，对人体的健康造成极大的威胁。癌症对人体器官的结构和功能破坏巨大，患者死亡率较高，一直以来都是世界范围内医疗健康领域的难题，困扰着众多癌症患者及其家人。目前，手术治疗、放射治疗（放疗）和化学治疗（化疗）是传统治疗癌症主要方法。然而，这些治疗手段早已无法满足临床癌症患者的需求，因为它们一般都伴随着较大的副作用，而治疗效果又十分有限。因此，研究人员不断探索新型的癌症治疗手段，旨在提升新方法对癌症疗效的同时，降低治疗产生的毒副作用从而减少对患者在治疗期间的生活质量的影响REF_Ref5849\r\h[1]。近年来新兴的光动力疗法正是能满足上述需求的众多研究成果之一。光动力疗法（PDT）是一种新兴的癌症治疗手段，光敏剂（Ce6）被特定波长的激光照射后会引发一系列光化学反应，与环境中的氧气共同作用，产生具有细胞毒性的活性氧（ROS），这种活性氧能使肿瘤细胞坏死或凋亡，同时引起机体产生强烈的免疫反应，从而起到治疗癌症的作用REF_Ref5882\r\h[2]。PDT相对传统癌症治疗方法，仅有很小的副作用，其中一个原因是由于光敏剂被激光照射后产生的ROS存在时间十分短暂，扩散范围有限，所以PDT产生的细胞毒性只会发生在激光照射的区域。这种治疗手段相对传统的化疗、放疗等手段，具有治疗效果较好、不良反应较少，同时具有靶向性等优点，已被广泛运用在临床肿瘤治疗中REF_Ref5921\r\h[3]。影响PDT疗效有三大要素，分别是光敏剂、光和分子氧，因此，掌握并调整光敏剂的剂量、激光的参数和肿瘤环境中的氧浓度，才能使PDT达到最佳的治疗效果REF_Ref5970\r\h[4]。1.2肿瘤微环境（TME）在肿瘤的形成和发展离不开肿瘤细胞直接存在和生长的细胞环境——肿瘤微环境（TME）。TME不止含有肿瘤细胞，还有其他细胞如免疫细胞、组成血管的上皮细胞、成纤维细胞等，其中还含有各类大分子蛋白如糖蛋白、酶和一些细胞生长因子REF_Ref6026\r\h[5]。TME中各种组分互相影响，共同作用，最终形成了与身体正常细胞组织不同的环境特征，其中，缺氧、微酸和高压是最为突出的特征REF_Ref31527\r\h[6]。大多实体肿瘤都有着缺氧的特征。由于肿瘤细胞大量消耗氧气用于其无限的增殖，而肿瘤中的血管环境异常，导致TME中耗氧速率和供养速率严重失衡，形成缺氧的特点。缺氧的环境又有利于肿瘤细胞的生存、繁殖和转移，同时降低免疫系统的能力，加大了癌症的治愈难度REF_Ref6058\r\h[7]。同时，PDT是耗氧过程，需要大量氧气参与治疗，加快了肿瘤部位对氧气的消耗，加重了TME中缺氧的程度，而这反过来又抑制了PDT的治疗效果。微酸性是肿瘤组织的又一特征。肿瘤细胞相较正常细胞有其独特的代谢方式，在其生长发育过程中产生大量乳酸、过量的质子及二氧化碳，而这些代谢废物又无法及时通过肿瘤中异常的血管排出，导致酸性代谢物集中在肿瘤组织部位，使TME持续处于酸性，与人体正常组织弱碱性环境有所区别REF_Ref6091\r\h[8]。酸性环境对于多数细胞来说都是有害的，但是对于肿瘤细胞来说，酸性环境能够诱发细胞突变，加速肿瘤细胞的形成和扩散，组成酸性环境的成分之一乳酸的产生又能抑制身体的免疫应答；而与之相反的，酸性环境在某些方面又可能抑制肿瘤细胞增殖REF_Ref14019\r\h[9]。总而言之，酸性环境对肿瘤细胞的生长和增殖的影响是复杂多样的。而研究人员可以利用肿瘤的酸性环境，设计响应微环境的靶向药物，减少药物在人体其他部位的释放，降低副作用REF_Ref8460\r\h[10]。1.3聚合物在癌症治疗方面的应用聚合物纳米材料已被应用到癌症治疗中。纳米材料在PDT中起到重要的作用，可作为光敏剂的载体，其自组装的疏水内核能有效地将光敏剂等药物包裹在内，防止药物在治疗过程中分解和失活，从而提高光敏剂的稳定性REF_Ref8505\r\h[11]。聚合物自组装的疏水内核中可搭载氧，通过血管运输至肿瘤部位释放REF_Ref8545\r\h[12]。含氟化合物较好的携氧能力REF_Ref8594\r\h[13]，将氟嵌段引入聚合物，形成含氟嵌段聚合物。利用氟对氧气的高溶解性和聚合物自主装疏水内核本身对氧气的负载，使得这种聚合物能装载大量氧气，能有效缓解肿瘤部位的缺氧微环境，增强PDT疗效REF_Ref8623\r\h[14]。同时，聚合物可针对肿瘤的酸性微环境作出响应，如一些纳米材料在不同pH环境中表现出不同的理化性质，如较低pH环境中纳米材料稳定性降低、粒径增大，使其中负载的药物可以针对肿瘤酸性微环境实现的可控释放，提高治疗的效果，降低副作用REF_Ref8649\r\h[15]。综上所述，针对肿瘤的缺氧、酸性微环境，可以设计一种pH响应的含氟聚合物纳米颗粒载体，对肿瘤组织微酸环境进行识别，并实现pH响应的氧气或药物释放，降低药物副作用。而聚合物中的氟嵌段能使得聚合物拥有更好的载氧性能，负载更多氧气并响应释放，以缓解TME中的缺氧问题，提高PDT或其他肿瘤治疗方法的疗效。1.4文章选题思路及研究方向相比传统的癌症治疗方法，新兴的PDT由于其具有非侵入性、局部性等特点，满足了癌症患者一些需求。但是，PDT在实际应用中的效果依然不尽人意，如肿瘤缺氧微环境会降低PDT的疗效。因此，如何提高PDT的疗效，如何避免因缺氧而降低PDT疗效，如何降低药物对人体的毒副作用，需要我们在研究中不断地探索和创新。pH响应纳米材料在肿瘤治疗中具有控制释放和增强药物稳定性等优点REF_Ref8675\r\h[16]。氟化两亲性嵌段聚合物能够在一定条件下形成具有自组装的疏水内核的纳米颗粒，具有较高的载药和载氧能力，有望在药物的装载运输和定点释放领域得到广泛的运用。本研究通过对含氟嵌段聚合物PDP的载氧及释放能力、活性氧ROS生成量以及光动力毒性等方面的研究，对PDP在治疗肿瘤乏氧领域的应用进行探索，发现其具有较好的pH响应及光动力治疗活性。2实验原理图1为本次研究的实验原理示意图。利用PDP两亲性自组装形成了疏水内核结构，由于其内部含有氟化链，能将Ce6装载到PDP的疏水核心中。同时，由于PEOFA嵌段内含有氟，能够大量地负载氧气，释放至肿瘤部位的微环境中，缓解其缺氧的问题。在对体外肿瘤细胞的实验中，利用特定波长的激光照射肿瘤细胞，内部装载的Ce6产生并释放活性氧（ROS），诱导肿瘤细胞死亡。pH响应氟化嵌段聚合物（PDP）具有明确的结构组成和较高的稳定性，考察该材料体外的抗肿瘤活性，以研究其在增强肿瘤PDT疗效方面的应用。图1实验原理图3实验内容与方法3.1实验相关试剂主要试剂有DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶、Hoechst33342染色液、DCFH-DA探针、pH响应氟化嵌段聚合物PDP（分子式如图2）、二甲基亚砜（DMSO）、单线态氧荧光探针（SOSG）等。图2pH响应氟化嵌段聚合物PDP3.2实验相关仪器主要仪器有激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)、荧光分光光度计、YSI550A便携式溶解氧仪、倒置显微镜等。3.3实验细胞与材料实验使用的细胞是人乳腺癌细胞（MCF-7）。MCF-7细胞培养在湿度饱和，CO2含量为5%的37℃恒温培养箱，使用培养基为加入了少量青霉素、链霉素和10%体积胎牛血清的DMEM培养基。使用的材料为一种含氟嵌段的pH响应聚合物PDP，并将其装载了Ce6构成载药的纳米粒子，研究了其在抗肿瘤活性方面的部分应用。3.4细胞的培养细胞的培养过程主要包括更换培养液和细胞传代。进入细胞培养室前需严格按照规范用洗手液洗手、戴手套、换上实验室专用拖鞋并使用75%酒精对双手消毒，从细胞培养箱中小心取出培养瓶，通过实验室内的显微镜，观察细胞生长状况和数量，以决定进行换液或传代操作。在进行细胞换液或传代前，为确保无菌环境，需对超净台进行30min紫外线照射杀菌消毒。在超净台中央点燃酒精灯，方便后续实验对培养瓶口消毒，使用酒精棉球擦拭超净台。在细胞培养瓶瓶口部分喷少量75%酒精消毒后放入超净台，使培养瓶直立瓶口向上且尽量靠近酒精灯火焰，避免其被细菌污染。在需要进行实验操作时，再将培养瓶瓶口靠近酒精灯火焰杀菌，轻轻拧开瓶盖并按顺序摆放。打开培养瓶后，弃去将瓶中的培养液，再用1mL的PBS溶液清洗细胞2至3次，以去除残留的培养液和杂质。若需进行换液操作，则只需加入3mL的DMEM，倒放并轻摇培养瓶使培养液覆盖细胞层，再将培养瓶放回恒温培养箱。若需进行传代操作，则需加入1mL胰蛋白酶后盖紧瓶盖，使其覆盖整个细胞层，放入恒温箱消化，根据胰蛋白酶的浓度不同，消化时间一般在3到5分钟之内。在显微镜下观察到大部分细胞呈现亮圆点时说明消化完成。用75%酒精消毒瓶口后放回超净台，倒出胰蛋白酶溶液，加入3mL的DMEM，用移液枪吹洗细胞表面，使细胞均匀分散至培养液中形成细胞悬液。最后按需求弃去1.5至2mL悬液，向培养瓶中加入DMEM至3mL，使其覆盖整个细胞层后放回恒温培养箱中继续培养。3.5PDP的载药与pH响应释放能力称取500μgPDP，和过量Ce6固体先溶解于100μLDMSO中。待固体完全溶解在DMSO中后，滴入5mL蒸馏水中。为使溶液分散均匀，将溶液超声15min。将MWCO=3500Da透析袋裁剪至合适大小，浸入无水乙醇中以90℃隔水加热半小时。将超声后的溶液转移至处理后的透析袋中，使用4L生理盐水中对溶液透析24h，以除去溶液中过量是游离Ce6，得到较纯净的PDP@Ce6纳米颗粒。为了测评PDP在体外模拟肿瘤微酸环境中的药物释放能力，将上述制备的PDP@Ce6溶液稀释至200μg/mL，取等量溶液分别加入两个透析袋。分别在两个5L烧杯中盛取新的4L生理盐水，向一个烧杯中并加入HCl，调整其pH至5，测得另一个烧杯中pH为7.4，将透析袋分别放入其中透析。间隔一定时间进行取样，用紫外-可见光谱法测量生理盐水中吸光度的变化，根据实验所得数据分析PDP在pH为5的酸性生理盐水环境下的释药速率，并与其在中性生理盐水中的释药速率进行对比。3.6PDP的载氧与释放能力PDP有较好的携氧能力，是因为材料中具有含氟嵌段。为避免YSI550A便携式溶解氧仪测得的数据被溶液中的预溶解氧影响，预先向10mL蒸馏水中通入足量氮气。再向已去除溶解氧的蒸馏水加入10mgPDP，同时，取等量等浓度的无氧PBS溶液和蒸馏水以形成对照，用橡胶塞塞紧瓶口。向容器中通入过量氧气使溶液中氧气含量达到饱和。停止通入氧气后，依次向溶液中插入溶氧仪氧探针，测定30min内各液体中的氧含量的变化。3.7PDP@Ce6体外活性氧生成能力利用SOSG荧光探针检测PDP@Ce6纳米颗粒在溶液中生成单线态活性氧的能力。将制得的取PDP@Ce6纳米颗粒稀释至1mg/mL，取3mL溶液置于石英比色皿中，在另一个比色皿中加入3mL等浓度的游离Ce6溶液。向比色皿中分别加入50μM荧光探针，使两个比色皿在相同条件下用激光照射10min，激光波长为660nm，激光强度为0.5W/cm2。最后使用荧光分光光度计在525nm处测量荧光强度。3.8PDP@Ce6细胞内ROS检测使用激光共聚焦显微镜测评细胞内ROS生成情况。在三个玻底培养皿中培养MCF-7细胞12h以上，确保细胞生长情况接近且正常。向两个培养皿中分别加入1.5mL稀释至4μg/mL的PDP@Ce6溶液，再将细胞放回原培养箱中培养2h。然后，用无氧PBS洗涤细胞以去除PDP@Ce6和杂质。再向三个培养皿分别中加入1.5mLDCFH-DA探针，放回原培养箱中培养30min，使探针与细胞充分结合。用无氧PBS洗涤各皿中细胞2次以彻底除去杂质。取一个加入了PDP@Ce6的培养皿置于激光照射环境下10min，激光波长为660nm，激光强度为0.5W/cm2，其他培养皿继续在黑暗中培养。在观察细胞中图像前，用PBS洗涤细胞3次以去除杂质，最后再加入1mLPBS使细胞保持湿润状态。使用激光共聚焦显微镜捕捉各皿细胞的荧光图像。3.9PDP@Ce6细胞内光动力毒性测试采用MTT法测试纳米颗粒对细胞的毒性和对PDT的增强效果。分别制备25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL的PDP和PDP@Ce6纳米颗粒溶液，摇匀备用。将等量细胞分别置于3个96孔板中，尽量保证各孔细胞浓度一致。向其中一板的各列中依次加入100μL不同浓度的PDP溶液，尽量保证同列的各孔中溶液体积相等。向另外两板中以相同的方法加入PDP@Ce6溶液。将细胞放回培养箱中培养24h以上，使细胞与纳米颗粒充分结合。将两个加入了PDP@Ce6溶液的细胞分别置于激光照射下和黑暗环境下，形成激光组与非激光组。激光组细胞置于激光照射下10min，非激光组置于其他条件相同的黑暗环境下。处理后将细胞放回培养箱继续培养20h。向各组细胞中加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液后在培养箱中培养4h。倒出上清液，此时细胞已基本贴壁。向每孔加入150μL的DMSO溶液，用酶标记测定细胞在570nm处的吸光度，并据此计算细胞存活率。4结果与讨论4.1PDP载药后pH响应释放能力评价将装载了Ce6的PDP@Ce6溶液置于不同pH值的环境中以测试材料在不同pH下的药物释放能力。将PDP@Ce6溶液分别置于模拟肿瘤内微酸环境（pH=5）的生理盐水和模拟人体正常细胞环境（pH=7.4）的生理盐水中，利用紫外-可见光谱法测量材料在不同时间间隔内吸光度的变化，并绘制PDP@Ce6药物释放曲线，得到实验结果如图3，根据图3中特征峰的降低量作出图4。由图4可知，在pH=5的酸性环境下，24h后药物释放率已达到80%以上，与之相比同一时间间隔内，pH=7.4环境中药物释放率低于20%。实验结果表明材料在酸性环境下有较高的药物释放速率，说明材料具有一定的pH响应释放能力。图3透析后PDP@Ce6在不同pH溶液中吸光度变化，（A）溶液pH=5，（B）,溶液pH=7.4图4透析后PDP@Ce6在pH=5和pH=7.4溶液中药物释放速率4.2PDP载氧能力评价氟化聚合物可以通过氧与氟之间的范德华相互作用溶解氧。为评价材料对氧气的装载能力，先通入氮气除去蒸馏水中预溶解的氧气，再加入PDP，向溶液中通入过量氧气使PDP充分装载氧气，最后使用便携式溶解氧仪测定溶液中氧浓度的变化，检测后得到的结果如图5。分析图像可以看出，在相同的实验条件下，PDP溶液在停止通入氧气600s后的含氧量仍有21mg/mL，相比之下，PBS溶液和水中的含氧量在600s后均低于16mg/mL，可以对比得出PDP有着较高的载氧量。由于溶液中的氧气不断扩散至外界环境的同时溶氧仪电极对氧气进行消耗，溶液中的氧气含量逐渐降低，但是PDP溶液中含氧量随时间降低的幅度较为平缓，显示出较好的稳定性。由此可知，PDP纳米颗粒可以在长时间储存较多氧气，在PDT中可作为可靠的氧气载体，改善TME的缺氧环境。图5停止通入氧气600s后PDP溶液、H2O、PBS中氧含量对比4.3PDP的体外活性氧生成能力评价氧气浓度的升高可以促进ROS的生成，ROS含量的升高可以加剧对细胞的损伤程度REF_Ref8731\r\h[17]。通过荧光强度检测活性氧的生成，分析荧光强度的强弱可以评价溶液中物质活性氧的生成能力，这是由于当SOSG活性氧荧光探针被氧化时，荧光强度会相应增强。如图6所示，PDP纳米颗粒被激光照射后，荧光强度明显比游离的Ce6溶液强，而PBS溶液的荧光强度相对较低。由实验数据分析可知，PDP纳米颗粒溶液中产生了较多ROS，这是由于PDP溶解氧的能力较好，被激光照射后能有效地促进ROS的生成。因此，PDP纳米颗粒的体外活性氧生成能力较好。图6使用SOSG活性氧荧光探针测得的PDP、Ce6和H2O的荧光强度对比4.4PDP的细胞内活性氧生成能力评价以DCFH-DA作为ROS生成指示剂，使用激光共聚焦显微镜（CLSM）检测MCF-7细胞内产生ROS的情况。探针被ROS氧化后，转化为DCF，在显微镜下能观察到亮绿色荧光，生成的图像如图7。图7中第一列图像由上至下分别为加入PBS后细胞内产生的ROS氧化SOSG探针发出的绿色荧光，细胞的细胞核被Hoechst33342染料染色后呈现的蓝色荧光，和叠加两种荧光图像后得到的荧光图像。第二列是加入PDP@Ce6后细胞一系列的荧光图像，第三列是加入PDP@Ce6后再经过激光照射的细胞荧光图像。由图像可知，经PBS处理的细胞或未经激光照射的PDP@Ce6纳米颗粒处理的细胞只发出微弱的蓝色荧光，说明此两组细胞内产生的ROS较少。而经PDP@Ce6处理的同时进行激光照射的细胞在显微镜下可以观察到明显的亮绿色荧光，说明细胞内产生了大量ROS。图7细胞内产生活性氧CLSM图像利用激光共聚焦显微镜进一步定量分析了荧光强度如图8，结果与直接观察到的荧光强度基本吻合，进一步验证了观察得到的实验结果。由定量分析结果可知，PDP@Ce6+L组的荧光强度高达143，明显高于PBS组和未经激光照射的实验组。说明纳米颗粒在光照条件下具有较好的ROS生成能力。图8定量分析各组荧光强度4.5PDP体外光动力效果评价通过MTT法检测了不同浓度的PDP和PDP@Ce6（激光组和非激光组）对细胞的毒性。对于单独PDP载体如图9，当载体浓度达到600μg/mL时，细胞的存活率依然保持在70%以上，即单独的PDP载体对细胞的伤害较小。图9不同浓度PDP下细胞存活率相比之下，图10中向体系内加入PDP@Ce6颗粒并经激光照射，细胞存活率下降幅度较大，在PDP@Ce6浓度仅为10μg/mL时，细胞存活率下降至50%左右。这是因为光照条件下PDP有效载氧并产生大量ROS，最终导致了细胞死亡。同时，非激光组的细胞存活率始终保持在80%以上，即无激光照射下，PDP@Ce6没有表现出明显的细胞毒性。二者对比可以发现在PDP@Ce6浓度高于2.5μg/mL时，激光照射组的细胞存活率出现显著的降低趋势，表现出明显的细胞毒性。图10PDP@Ce6在光照条件和非光照条件下培养的细胞存活率综上所述，单独的PDP和PDP@Ce6纳米材料对细胞没有较大的毒性，当有激光照射时，PDP@Ce6才会将负载氧转变为ROS，对肿瘤细胞造成损伤。5结论本次研究成功探究了PDP在抗肿瘤活性方面的应用。研究的聚合物PDP具有较高的载氧能力，聚合物形成的自组装的疏水内核能有效负载氧，在肿瘤部位释放氧气，从而缓解TME中的缺氧问题。PDP负载的药物能够在酸性条件下响应释放，具备一定的pH响应性。经体外实验可以看出，PDP装载Ce6后，可在激光照射下产生大量ROS，从而损伤肿瘤细胞，增强PDT的肿瘤治疗效果。本项实验展示了pH响应的氟化嵌段聚合物PDP在抗肿瘤活性方面的部分应用，氟化嵌段聚合物在增强PDT方面具有一定的可行性。嵌段聚合物纳米材料在抗肿瘤方面的应用在未来有着十分广阔的前景，值得研究者继续深入地探究。

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