Cry9蛋白嵌合体的构建与功能分析

图9所示：图SEQ图\*ARABIC9CPY21和CPY22琼脂糖凝胶结果图注：A：CPY21重组子电泳图；泳道1：cry9Eb-cry9Aa嵌合质粒；泳道2：pET28a质粒；泳道3：cry9EbN和M端；泳道4：cry9AaC端；泳道5：cry9Eb-cry9Aa嵌合酶切；B：CPY22重组子电泳图；泳道1：cry9EbC端；泳道2：cry9AaNM端；泳道3:pET28a质粒；泳道4：cry9Aa-cry9Eb嵌合质粒；泳道5：cry9Aa-cry9Eb质粒嵌合酶切。Cry9-like嵌合基因的表达与纯化在本研究中，为了表达CPY21和CPY22蛋白，首先将含有相应基因的菌株进行过夜活化。随后，分别取100μL活化后的菌液转接至100mL含有Kan抗生素的液体LB培养基中，并在37℃、180rpm的条件下培养1.5-2小时。当菌液的光密度（OD600）达到0.6时，分别加入0.3mM和0.4mM的IPTG，以诱导CPY21和CPY22蛋白的表达。接着，在16℃的低温条件下诱导培养16-18小时，以确保蛋白的充分表达。实验结果表明，CPY21和CPY22蛋白均为可溶性蛋白。进一步的电泳分析显示，表达的CPY21和CPY22蛋白的条带大小均在75-95kDa左右，与蛋白分子量大小的预测结果相一致，从而验证了蛋白表达的准确性。图SEQ图\*ARABIC10CPY21、CPY22蛋白SDS电泳图Cry9-like蛋白的生物活性测定使用可溶性毒素蛋白CPY21、CPY22对甜菜夜蛾、棉铃虫、草地贪夜蛾和玉米螟进行了生物活性的测定，测试结果表明嵌合蛋白对上述虫子几乎都没有活性。表SEQ表\*ARABIC16毒素蛋白生物活性测定毒素蛋白玉米螟草地贪夜蛾棉铃虫甜菜夜蛾CPY21NANANANACPY22NANANANA注：“A”表示具有生物活性；“NA”表示没有生物活性。结论长期过度使用化学农药已造成严重的环境污染与人畜受害问题，同时害虫对常规防治手段的抗性也在逐渐增强。因此，以Bt为代表的生物防治手段逐渐受到广泛关注。然而，长期使用单一基因进行害虫防治使得害虫对现有抗虫基因产生抗性的风险日益上升，这对Bt杀虫蛋白的未来应用构成了巨大的威胁。为了有效阻止或延缓昆虫抗性的产生，挖掘新型杀虫基因资源或采用基因叠加策略成为了重要的解决途径ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>徐卓吟</Author><Year>2016</Year><RecNum>24</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[30]</style></DisplayText><record><rec-number>24</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0a2e00xs5svdxjevd9m5r9t92wzf2tw0x52f"timestamp="1713506146">24</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>徐卓吟</author><author>楼杨</author><author>张俊</author></authors></contributors><auth-address>福建农林大学生命科学学院;福建农林大学植物保护学院;福建农林大学林学院;</auth-address><titles><title>Bt毒素的改造策略</title><secondary-title>农村经济与科技</secondary-title></titles><periodical><full-title>农村经济与科技</full-title></periodical><pages>275-276</pages><volume>27</volume><number>16</number><keywords><keyword>Bt</keyword><keyword>截断毒素</keyword><keyword>噬菌体展示</keyword><keyword>PACE技术</keyword></keywords><dates><year>2016</year></dates><isbn>1007-7103</isbn><urls><related-urls><url>/kcms2/article/abstract?v=KPcMkpFoYBB6BLUCmUtbfl8vmAcgzKmen9ViKPCXj3bwvTRqjmDzFQRFupBgoLLwK4g6qj_GsuPPp1-3e5RCYy1DNY3tAP6TRNsq7zlnK7M1lbnVwzJDfNPHts5KF1ZryGphA8i3mVYc53ZOVVX3aA==&uniplatform=NZKPT&language=CHS</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[30]。本研究首先通过广泛的微生物资源筛选，成功从土壤中分离出具有高效杀虫活性的BtZ197-2菌株。这一菌株对小菜蛾和玉米螟等鳞翅目害虫表现出显著的杀虫效果，为我们后续的研究奠定了坚实基础。通过二代与三代全基因组测序技术的综合运用，我们深入剖析了BtZ197-2菌株的基因组结构，发现了多个编码杀虫蛋白的基因，其中就包括我们重点关注的Cry9类杀虫蛋白。Cry9类杀虫蛋白作为一种新型的杀虫蛋白，其与应用广泛的Cry1和Cry2蛋白的受体结合位点存在显著差异，这为我们解决害虫抗性问题提供了新的思路。为了进一步提升其杀虫活性和拓宽杀虫谱，我们尝试利用基因工程技术对Cry9基因进行改造。通过设计特异性引物，我们在体外成功扩增出目的片段，并采用多片段克隆技术构建了嵌合基因。随后，这些基因被转入感受态细胞中进行体外表达，以获取杀虫蛋白，并对其进行了生物活性测定。然而，实验结果表明，经过改造的CPY21与CPY22嵌合蛋白对所测定的昆虫活性并不强。这提示我们，单纯的基因结构域置换可能并不足以显著提升杀虫蛋白的活性。我们深知，杀虫蛋白的杀虫机制是一个复杂的生物学过程，涉及到蛋白与害虫肠道细胞的相互作用、蛋白的空间构象变化以及其与受体的结合等多个环节。因此，我们需要更深入地理解这些环节之间的相互作用机制，才能更有效地进行基因改造和蛋白优化。尽管初步的生物活性测定结果并未达到预期效果，但本研究为后续基因改造和毒素蛋白的优化提供了重要的参考价值和方向指引。首先，我们可以尝试对其他类型的杀虫蛋白进行类似的基因改造和嵌合实验，以寻找更具活性的杀虫蛋白。其次，我们可以通过定点突变、饱和突变等技术手段对现有的杀虫蛋白进行精细调控，以进一步提升其杀虫活性和稳定性。此外，我们还可以考虑将多种杀虫蛋白进行基因堆叠，以同时表达多种杀虫蛋白来增强防治效果并降低害虫产生抗性的风险。除了上述的实验研究外，本研究还强调了多策略并行在害虫防治中的重要性。在实际应用中，我们可以将生物防治与其他防治方法相结合，如物理防治、化学防治以及农业防治等，以形成综合的害虫防治体系。这种多策略的防治方法不仅能够提高防治效果，还能够降低对环境的污染和对害虫的选择压力，从而延缓害虫抗性的产生。综上所述，本研究通过综合运用微生物资源筛选、基因组分析、基因工程技术和生物活性测定等手段深入探索了新型BtZ197-2菌株及其所含的Cry9类杀虫蛋白在害虫防治中的应用潜力。尽管实验结果并未完全达到预期效果但我们从这一研究中获得了宝贵的经验和教训为后续的研究提供了重要的参考和启示。我们相信随着研究的深入进行我们将能够开发出更高效、更环保的害虫防治方法为我国农业的可持续发展做出更大的贡献。参考文献ADDINEN.REFLIST[1]顾晓峰,阴启星,孙兴民,张娓娓,和王晓锋,苏云金杆菌的分类研究综述.现代园艺43(2020)11-12.[2]金嘉凤,沈成,孟萌,陈蔚,徐重新,刘媛,和刘贤金,苏云金芽孢杆菌Cry毒素共性结构短肽串联表达及功能分析.河南农业科学53(2024)96-104.[3]VanFrankenhuyzenK.,GringortenL.,andGauthierD.,Cry9Ca1Toxin,aBacillusthuringiensisInsecticidalCrystalProteinwithHighActivityagainsttheSpruceBudworm(Choristoneurafumiferana).Appliedandenvironmentalmicrobiology63(1997)4132-4.[4]陈喆,苏云金芽孢杆菌分泌型杀虫蛋白Vip3Aa及Sip1Ab的构效关系研究,2023.[5]黄慧敏,曾远婷,和王磊,苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展.广东化工48(2021)86-87.[6]BravoA.,GillS.S.,andSoberónM.,ModeofactionofBacillusthuringiensisCryandCyttoxinsandtheirpotentialforinsectcontrol.Toxicon:officialjournaloftheInternationalSocietyonToxinology49(2007)423-35.[7]张文飞,苏云金芽孢杆菌杀虫成分的多样性及其杀虫机理,2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会,中国海南三亚,2005,pp.7.[8]刘婷婷,王英,郑丹,刘治隆,李昕,王静,和于莎莎,不同温度下苏云金杆菌对白纹伊蚊的杀虫效果研究.中国热带医学23(2023)1260-1265.[9]徐重新,金嘉凤,孙晓明,沈成,张霄,陈澄宇,刘贤金,和刘媛,基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略.中国农业科学57(2024)96-125.[10]FerryN.,EdwardsM.G.,GatehouseJ.,CapellT.,ChristouP.,andGatehouseA.M.,Transgenicplantsforinsectpestcontrol:aforwardlookingscientificperspective.Transgenicresearch15(2006)13-9.[11]RohJ.Y.,ChoiJ.Y.,LiM.S.,JinB.R.,andJeY.H.,Bacillusthuringiensisasaspecific,safe,andeffectivetoolforinsectpestcontrol.Journalofmicrobiologyandbiotechnology17(2007)547-59.[12]GarfieldJ.L.,andStoutC.D.,CrystallizationandpreliminaryX-raydiffractionstudiesofatoxiccrystalproteinfromasubspeciesofBacillusthuringiensis.TheJournalofbiologicalchemistry263(1988)11800-1.[13]吴洪福,郭淑元,李海涛,和高继国,苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展.东北农业大学学报40(2009)118-122.[14]苏慧琴,束长龙,何康来,张友军,高继国,和宋福平,苏云金芽孢杆菌cry9Aa基因的克隆、表达及活性分析.植物保护学报37(2010)541-546.[15]刘子铎喻.,苏云金芽孢杆菌及其杀虫晶体蛋白作用机制的研究进展.昆虫学报(2000)207-213.[16]符百文,许炼,郑梅霞,和朱育菁,苏云金芽胞杆菌Cry毒素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