Cry2A嵌合蛋白构建及其杀虫活性

Cry2A嵌合蛋白构建及其杀虫活性目录TOC\o"1-3"\h\u6590本科生毕业论文 1284141引言 7293471.1苏云金芽孢杆菌及其应用现状 7293691.2昆虫对Bt毒素产生抗性的现状 8209491.3Cry2类毒素 9217781.4Cry类毒素定向进化 10280611.5本研究目的及意义 12290372材料与方法 1284692.1实验材料 12139542.1.1实验菌株与质粒 12184342.1.2实验试剂 1385392.1.3实验仪器及设备 1487522.2实验方法 1555722.2.1Bt菌株基因组DNA提取 15170902.2.2E.coli质粒DNA提取 1599272.2.3PCR扩增 16294812.2.4无缝克隆表达载体构建 18144332.2.5毒素蛋白表达 19283082.2.6生物活性测定 19275463结果与分析 20169183.1Cry2A-like毒素基因的克隆 2042623.2Cry2A-like表达分析 21160933.3Cry2A嵌合毒素的设计与克隆 22303893.3.1Cry2A嵌合毒素的设计 2259253.3.2Cry2A嵌合毒素的克隆 23285723.4Cry2A嵌合毒素的表达分析和生测 23173633.4.1Cry2A嵌合毒素的表达分析 23198453.4.2Cry2A嵌合毒素生物活性的测定 24327334讨论 264923参考文献 2820450致谢 29摘要：苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）的昆虫特异性毒素为害虫防治提供了有效手段，初期应用效果显著。然而，随着单一使用Bt农药，昆虫对Bt杀虫剂的敏感性已发生显著变化。在海南岛热带雨林土壤中，成功分离出一株典型芽孢杆菌Z149-5，并从中筛选并鉴定到一种新型Cry2A-like毒素。但经生物活性测定，该毒素对小菜蛾（Plutellaxylostella）和棉铃虫（Helicoverpaarmigera）的杀虫活性并不显著。为发掘更多新型杀虫基因资源或提高毒素效力，以阻止或延缓昆虫抗性，本研究采用cry2A-like和cry2Ab基因结构域置换策略，构建了两种嵌合蛋白Cry2A-1和Cry2A-2。生物活性测定结果表明，这两种嵌合蛋白对小菜蛾和棉铃虫的杀虫活性均优于Cry2A-like毒素。本研究成功构建的两种嵌合杀虫蛋白，为Bt类杀虫蛋白家族增添了新成员。关键词:苏云金芽孢杆菌；Cry2A；嵌合改造；生物活性测定引言苏云金芽孢杆菌及其应用现状苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性杆菌。起初，是由日本学家石渡在病死的幼蚕发现Bt菌REF_Ref24056\r\h[1]，之后德国贝尔奈又在地中海粉蛾发现与之类似的细菌，发现并详细描述了该菌的形态和培养特征，从此正式命名为“苏云金芽孢杆菌”REF_Ref24451\r\h[2]。经过深入研究，我们发现Bt菌株具备产生多种高效毒杀毒素的能力，这些毒素被细致划分为内毒素和外毒素两大类。外毒素特指细菌在代谢过程中释放至细胞外部的毒素，其主要包括α-外毒素、β-外毒素和γ-外毒素。而内毒素则主要由杀虫晶体蛋白（Insecticidalcrystalproteins，简称ICPs）和营养期杀虫蛋白（Vegetativeinsecticidalproteins，简称Vips）构成REF_Ref21929\r\h[3]。这些毒素对昆虫和其他靶标具有显著的毒杀效果。Bt菌以其独特的生物活性，被广泛用于生物农药的制造，以控制多种农业害虫。由于化学农药的滥用，导致部分害虫产生了抗药性，同时，对动植物、人类及其生态环境也带来了潜在威胁。鉴于此，Bt制剂作为一种微生物杀虫剂，其优点在于对土壤环境影响较小、降低农药残留、且具备长期持久的杀虫效果，因此，受到了广泛的关注和重视。经过深入研究与开发，我国在Bt生物农药领域的应用技术已跻身国际先进行列。新型发酵设备的运用以及成熟的工业发酵技术，配合多样化的剂型，为我国Bt悬浮剂和高效价粉剂的优质生产提供了坚实的技术支撑，极大地推动了Bt杀虫剂的商业化进程。此外，我国还建立了基于生物测定的产品质量效价标准化技术系统，并对助剂及贮存条件对Bt的影响进行了深入研究，为科学筛选助剂和有效存贮提供了可靠依据REF_Ref22082\r\h[4]。在实际应用中，Bt杀虫剂已在棉、粮、果蔬及林业害虫防治中得到广泛应用，并取得了显著的防治效果REF_Ref18172\r\h[5]。这一成就的取得，不仅体现了我国农业科技的进步，也为保障农业生态安全、减少化学农药残留、保护人类健康及生态环境作出了积极贡献。Bt毒素在农业领域的应用广泛，不仅作为喷雾制剂使用，而且被整合到植物转基因技术中，用以保护玉米、棉花、大豆和马铃薯等农作物免受昆虫侵害。据全球统计，目前约有12%的转基因作物种植面积采用了经过改良的抗虫性状。随着科研工作的持续推进，科研人员成功地分离并鉴定了越来越多的Bt基因。这些基因所编码的蛋白质，包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ab2、Cry2Ae、Cry3Bb1、Cry34Ab1和Cry35Ab1等，经过测定均展现出了显著的杀虫活性。基于这些发现，这些基因已被广泛应用于抗虫转基因作物的研发中REF_Ref25274\r\h[6]。我国自1993年成功培育出Cry1ABt抗虫棉以来，转基因棉花得到了迅速推广和应用。至2020年，我国已先后批准了表达Cry1Ab和表达Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白的2个转基因玉米“DBN9936”和“瑞丰125”的生产应用安全证书。此外，转基因抗虫玉米在全球范围内也得到了商业化种植。1997年，美国环保署正式批准了4种转Bt基因玉米的商业化种植，包括采用cry1Ab基因的“176”、“Bt11”、“MON810”和采用cry1Ac基因的“DBT-418”REF_Ref27198\r\h[6]。这些转基因玉米的主要防治对象均为玉米螟虫REF_Ref25490\r\h[7]。以及，转cry1C基因的籼稻表现出显著的外源基因高表达量和强抗螟虫性。为了进一步提升水稻的抗虫性，研究团队以北方粳稻年种植面积纪录品种‘空育131’为受体，运用根瘤农杆菌介导法以及后代系谱法进行了精心选择和培育。最终，成功培育出了转cry1C基因水稻新品种‘HD1’。REF_Ref25682\r\h[8]昆虫对Bt毒素产生抗性的现状Bt杀虫剂初期效果显著，昆虫还未对Bt杀虫剂的敏感性发生显著变化，但长期使用导致昆虫对其抗性增强。自2010年以来，黄河流域和长江流域棉区棉铃虫（Helicoverpaarmigera）对Cry1Ac的抗性水平显著提高，平均约3倍。全球多地已报道小菜蛾（Plutellaxylostella）对多种Bt杀虫晶体蛋白存在抗药性。陕西田间亚洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）经汰选获得5个高抗性种群，其中Cry1F蛋白抗性种群抗性倍数近2000倍。不同地理种群二化螟（Chilosuppressalis）对Cry1Ab和Cry1Ca毒素敏感性差异较小。随着长期使用Bt杀虫剂，必然会存在昆虫抗性进化的隐患。REF_Ref25855\r\h[9]关于昆虫抗性机制的形成，研究者普遍认为，这主要是由于Bt杀虫蛋白在昆虫中肠内的酶解、特异性结合等反应发生了变化。据Zhang等人的研究，抗性品系的甜菜夜蛾中肠缺乏类胰蛋白酶，这导致活化毒素的减少，进而削弱了Bt蛋白对昆虫的毒性。此外，一系列研究揭示，昆虫抗性品系的突变能够影响其中肠内的钙粘蛋白排列。钙粘蛋白基因的突变与烟芽夜蛾、烟草天蛾、棉铃虫等对Cry1Ac的抗性有着密切的联系REF_Ref26048\r\h[10]。这些发现为深入理解昆虫抗性的形成机制提供了新的思路。农业害虫对杀虫剂和转基因植物的抗性进化是农业领域的重要挑战，影响了防治效果，可能导致害虫数量反弹，威胁农业生产。为减缓昆虫对杀虫剂和转Bt基因植物的抗性进化，可采取多种措施延缓昆虫产生抗性。首先，减少杀虫剂使用频率是关键，降低昆虫抗性水平。其次，为应对害虫抗药性问题，我们必须实施轮换或混合使用不同作用机制的杀虫剂策略，以确保害虫不会对单一药剂产生抗性。此外，我们还应积极推广合理使用增效剂，以增强杀虫剂的效果，并有效抑制昆虫抗性的发展。除了化学防治，微生物杀虫剂也重要，与环境友好且不易引起抗性。基因工程改造病毒基因组和提高转基因植物抗虫能力也是潜在防治手段。实施“高剂量/庇护所”策略和RNAi技术与Bt毒素协同抗虫也是当前研究的热点。综上所述，针对昆虫抗性进化的挑战，我们应采取一系列综合措施。首先，要减少不必要和过量的杀虫剂使用，以降低害虫对药剂的依赖性和抗性风险。其次，要定期轮换使用不同类型的杀虫剂，避免害虫对某一药剂产生适应性。同时，我们还应积极探索和推广微生物杀虫剂等环保型防治手段，以减少对环境的污染和生态平衡的破坏。此外，我们还应加强科研力度，推动基因工程改造和双价或多价转基因植物抗虫技术的研发与应用。同时，实施“高剂量/庇护所”策略和RNAi技术与Bt毒素协同抗虫等创新方法，以提高防治效果和农业生产的安全性。通过这些综合措施的实施，我们将能够有效应对昆虫抗性进化的问题，保障农业生产的顺利进行，并为农民增产增收提供有力支持。Cry2类毒素Cry2类毒素是一个庞大的家族，涵盖了12个亚群（Cry2Aa至Cry2Ak，以及Cry2Bb）。这些毒素蛋白的大小约为70kDa，展现出高度相似的序列结构，但在杀虫特异性和杀虫谱方面却表现出显著的差异性。值得一提的是，其中的某些毒素对鳞翅目和双翅目幼虫具有双重活性REF_Ref26290\r\h[10]。在2017年，Shu等人对Cry2类杀虫蛋白的各个结构域进行了深入的聚类分析。他们发现，不同蛋白间在区域相似性上存在差异，并且结构域I对Cry2类蛋白的杀虫特异性起到了至关重要的作用。REF_Ref26290\r\h[11]。竞争结合实验表明，Cry2类蛋白与目前广泛用于防治鳞翅目害虫的Cry1A，Vip3A蛋白在棉铃虫中肠不竞争结合位点，它们之间不存在交互抗性，因此Cry2类蛋白是昆虫抗性治理的重要候选蛋白。REF_Ref26290\r\h[11]Cry2Aa，Cry2Ac，Cry2Ag等Cry2类蛋白对鳞翅目昆虫和双翅目昆虫均具有杀虫活性。李海涛首次报道了Cry2Aa对直翅目昆虫黄胫小车蝗的毒杀作用。Semih等人发现Cry2Aa18对双翅目害虫尖音库蚊有高毒力，可控制其传播的传染病。Cry2Ag1对埃及伊蚊、小菜蛾和棉铃虫均有活性REF_Ref26290\r\h[11]。Zhang等人从苔鲜植物中分离的Cry2Ac5对白纹伊蚊有活性。Saleem等人发现Cry2Ac7对棉铃虫和家蝇有杀虫活性，这是Cry2Ac对棉铃虫的首次报道。而Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Ae、Cry2Af、Cry2Ah和Cry2A1仅对鳞翅目害虫有活性，如Cry2Af2对棉铃虫有活性，Cry2A11对斜纹夜蛾和棉铃虫有活性，但对埃及伊蚊无活性。Lin等人发现Cry2Ab10对小菜蛾有高毒力REF_Ref26437\r\h[12]。Cry2Ah1对亚洲玉米螟有体重抑制活性，并对棉铃虫品系有生长抑制活性REF_Ref26531\r\h[13]。将cry2Ah1基因转到烟草中，对棉铃虫表现出高抗活性，表明植物中表达的Cry2Ah1蛋白具有正常杀虫活性。经过昆虫摄取后，Cry蛋白与中肠受体蛋白结合，其中包括钙粘素和ABC转运蛋白等，这是实现其杀虫作用的关键步骤。由于昆虫肠道的碱性PH和还原条件，昆虫摄入的Cry杀虫蛋白晶体包裹体会在肠腔中溶解，进而激活的Cry蛋白与位于中肠细胞微绒毛的钙粘蛋白受体结合。这一结合会导致细胞分裂和细胞死亡，最终使得目标昆虫的肠道活动丧失，直至昆虫瘫痪并最终死亡。值得注意的是，大多数的Cry蛋白在自然状态下是以非活性的原毒素形式存在的，这些原毒素会在某些昆虫的中肠蛋白酶的作用下转化为活性毒素。这种转化过程似乎是一系列连续的蛋白水解裂解反应，从C末端开始，逐步向N末端进行，直至生成蛋白酶稳定的毒素。REF_Ref26711\r\h[14]关于Cry毒素的作用机制，部分学者认为其膜穿孔模型与激活细胞内的信号通路紧密相关。他们认为，穿孔后细胞膜可能因渗透压升高而破裂，导致细胞死亡，同时激活的信号通路也可能引发细胞凋亡。这一观点强调膜穿孔与信号通路激活的并存与相互促进作用。此外，还有学者提出昆虫对体内毒素异物存在免疫应激反应，这一过程可能与杀虫作用相关。尽管研究人员对杀虫机制存在不同猜想，但截至目前，膜穿孔假说仍是最被广泛接受的杀虫机制。REF_Ref26815\r\h[15]Cry类毒素定向进化随着现代农业的发展，昆虫抗药性问题日益凸显，成为了制约农业可持续发展的重要因素。尤其是对于那些以Cry杀虫蛋白为主要防治手段的靶标昆虫，一旦它们产生抗性，便会使这种防治手段失去效果。因此，探索和研究新的策略来应对昆虫抗药性，显得尤为迫切。一种有效的策略是对Cry毒素进行截短。通过去除毒素中的某些部分，可以使其对靶标昆虫的毒性增强，同时降低对非靶标生物的影响。除了截短，嵌合改造也是一种有效的策略。通过将不同来源的Cry毒素进行嵌合，可以创造出具有新型杀虫活性的毒素。这种策略不仅可以拓宽Cry毒素的宿主范围，还可以提高其对某些特定昆虫的毒性。定点突变是另一种值得关注的策略。通过定点改变Cry毒素的氨基酸序列，可以精确地调控其杀虫活性和宿主范围。这种策略不仅可以避免对整个毒素进行大规模的改造，还可以更加精准地满足农业防治的需求。此外，筛选具有增强活性的突变毒素也是一种重要的策略。通过利用现代生物技术手段，科学家们可以在大量突变毒素中筛选出具有更高杀虫活性的突变体。这些突变体不仅可以提高Cry毒素的防治效果，还可以延长其使用寿命，降低抗药性的发生概率REF_Ref2590\r\h[16]。综上所述，针对昆虫抗药性问题，可以采取截短、嵌合改造、定点突变和筛选具有增强活性的突变毒素等策略来改进Cry毒素。这些策略不仅可以提高Cry毒素的杀虫活性和宿主范围，还可以降低对非靶标生物的影响，从而更加有效地防治农业害虫。鉴于农业害虫对Bt毒素产生的抗性日益增强，对Cry毒素进行人工改造以提升其对特定害虫的毒性，从而有效地杀灭新的靶标昆虫，显得尤为关键和重要。Cry毒素间的结构域交换，作为一种古老却仍具潜力的方法，被用于改造具有独特特性的毒素。此类大型结构域交换不仅证实了交换片段的功能性，还为毒素结合和宿主特异性研究提供了新的视角。Cry毒素间的结构域III交换揭示了该结构域在毒素与宿主互作中的关键作用。因此，3DCry毒素的结构域III成为了结构域交换实验的首选。值得一提的是，通过成功将Cry1Ia的结构域II转移到Cry1Ba，成功开发出了一种对十二月乳杆菌具有显著活性的新型毒素。此外，3DCry1毒素间的结构域III交换已被证明能够有效提升对特定害虫的毒性，并扩展至与原始毒素关系较远的3DCry毒素。一般而言，将一种Bt毒素的结构域III完全或部分替换为另一种毒素的结构域，能够使受体毒素获得供体毒素的特异性REF_Ref2590\r\h[16]。为了深入了解Cry2A类杀虫蛋白的杀虫机制，进行了大量的文献调研和实验研究。通过对比分析不同Cry2A类杀虫蛋白的结构与功能，发现其杀虫活性与特定的结构域密切相关。因此，通过交换结构域嵌合改造Cry2A-like，有望获得具有更高杀虫活性的新型生物杀虫剂。然而，关于Cry2A类杀虫蛋白的研究报道相对较少，这在一定程度上限制了其在农业领域的应用。因此，本研究旨在通过交换结构域嵌合改造Cry2A-like，以期发现更具潜力的生物杀虫剂。本研究目的及意义随着全球对农业可持续性的日益关注，生物技术在农作物保护方面发挥着越来越重要的作用。其中，Cry杀虫蛋白因其对特定昆虫的高效、环保杀虫效果而备受青睐。然而，Cry蛋白的毒性限制和宿主范围问题一直是制约其应用的瓶颈。近年来，对Cry杀虫蛋白的研究层出不穷。众多学者致力于通过基因工程手段对Cry蛋白进行改造，以提高其杀虫效果和拓宽应用范围。本研究针对Cry2A杀虫蛋白进行了深入的结构域交换与修饰研究，旨在克服当前存在的问题，提高其对特定靶标昆虫的毒性效力。通过结构域交换，成功地将Cry2A杀虫蛋白的关键功能区域与其他相关蛋白进行交换，从而产生了具有全新结构和功能的杂交蛋白。本研究不仅为Cry2类杀虫蛋白增添了新的成员，也为未来的农业害虫防治提供了新的策略和手段。材料与方法实验材料实验菌株与质粒本研究涉及的具体菌株与质粒见表2.1。Bt菌株Z149-5从海南岛热带原始雨林土壤筛选分离获得。芽孢杆菌在肉汤培养基（BrothMedium,LB）培养基。质粒pET-28a与pET-30a为大肠杆菌表达载体，均带有Kan抗性基因和6×His标签，选用了E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）分别作为克隆和表达的宿主菌，在37℃条件下LB中培养。经过精心培育，所有细菌均达到对数生长期，随后与15%浓度的甘油进行均匀混合。为确保其活性与稳定性，建议在-20℃或-80℃的低温环境下进行长期保存。表2.1菌株与质粒特征菌株或质粒特征描述来源Z149-5BacillusthuringiensisLabstockSW41-2BacillusthuringiensisLabstockE.coliDH5αR-,M-,AmpRLabstockE.coliBL2(DE3)F-,ompT,hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3)LabstockpET-28aKanR,His•Tag/thrombin/T7•TagNovagen实验试剂主要试剂配置方法见表2.2。表2.2主要试剂配置方法实验仪器及设备主要仪器见表2.3。表2.3主要仪器及设备仪器设备名称生产厂家型号高压蒸汽灭菌锅致微厦门仪器有限公司GR85DA恒温振荡培养箱上海智城仪器制造有限公司ZWY-211B转移电泳槽北京君意东方电泳设备有限公司JY-ZY6双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器TU-1901PCR仪德国耶拿分析仪器股份公司Blockassembly96G通用电泳仪北京君意东方设备有限公司JY200C小型冷冻高速离心机ThermoFisherScientificFresco21生化培养箱韶关泰宏医疗器械有限公司LRH-150B恒温恒湿培养箱上海力辰仪器科技有限公司HSP-70BE凝胶成像仪BIO-RAD721BR08616垂直电泳槽北京君意东方电泳设备有限公司JY-SCZ2+型漩涡混合器RATEKVM1恒温金属浴博日CHB-202大型冷冻高速离心力康发展有限公司Neofuge23R超声波破碎仪美国Sonics公司VCX800蛋白质凝胶扫描仪BIO-RADGS-800实验方法Bt菌株基因组DNA提取在无菌环境下，使用无菌牙签从Bt菌体中取样，并将其接种于新鲜LB培养基中。将接种后的培养基置于28℃恒温条件下，进行过夜培养。待菌体充分生长后，采用氯仿-酚抽提法提取Bt菌体的总DNA。该方法主要步骤包括见图2.2。图2.2主要步骤E.coli质粒DNA提取利用生工（SangonBiotech）的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，可以精确地从大肠杆菌中提取质粒DNA。该方法主要步骤包括见图2.3。图2.3主要步骤PCR扩增以细菌基因组DNA为模板，运用PCR技术扩增出所需的目的基因。所有必需的引物序列已在表中详细列出，在扩增该基因的两端引物时，需在其前端增加15~25bp的与载体插入位点互补的序列，以确保基因能够正确插入到载体中。在PCR扩增过程中，为确定最佳的退火温度，我们设置了温度梯度进行条件优化。一旦找到最佳条件，便使用这些条件进行大规模的目的片段扩增。同时，我们设计了一对反向扩增引物，用于线性化pET-28a载体。通过PCR方法实现载体的线性化后，对PCR产物进行纯化，并利用DpnI酶去除甲基化模板质粒，以避免在后续无缝克隆操作中产生不必要的干扰。完成去除甲基化模板质粒的纯化步骤后，得到的产物即可用于后续的无缝克隆操作。表2.4引物序列信息引物名称引物序列长度P2_190-FcagcaaatggtcgcggatccATGGATAGTGTATTGAATAGCGGAAG1914bpP2_190-RgtggtggtggtggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGAAC2AbNM-FcagcaaatgggtcgcggatccATGAATAGTGTATTGAATAGCGGAAGA1284bp2AbC-RgtggtggtggtggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGTACAFX86NM-FcagcaaatgggtcgcggatccATGGATAGTGTATTGAATAGCGGAAG1284bpFX86C-RgggggtgctcgagTTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGAACpET-28-FCTCGAGCACCACCACCACC5600bppET-28-RGGATCCGCGACCCATTTG表2.5PCR反应体系试剂剂量2×TaqMasterMix12.5μLPrimers（F/R10nM）1μL总DNA0.5μLAddwaterto25μL表2.6PCR反应的条件温度时间预变性95℃5min变性95℃1min退火55℃2min延伸72℃3min再延伸72℃5min保存4℃30min注：按照1Kb/min的扩增效率设置不同的延伸时间，变性、退火、延伸循环30次。无缝克隆表达载体构建根据诺唯赞无缝克隆试剂盒的说明书，将目的基因与载体进行连接。经过分析，选择特定的酶切位点，以构建线性化载体。这一过程中，采用了Cry2A-like作为示例，详细的酶切体系如表2.7所示。为了确保实验的准确性和稳定性，特别选用了XhoⅠ和BamHI作为酶切工具。该方法主要步骤包括见图2.4。图2.4主要步骤表2.7酶切反应体系ComponentVolumeOBuffer10μL载体40μLBamHI5μLXhoⅠ5μLddH2O40μLTotal100μL表2.8连接反应体系ComponentVolume目的基因XμLpET30a线型化载体YμL5xCEIIBuffer4μLExnaseII2μLAddwaterto20μL毒素蛋白表达经过实验验证，我们已成功将克隆子转化到BL21（DE3）表达菌株内。为确保转化操作的有效性，我们从转化后的菌落中随机选择了若干单菌落进行PCR验证，并对通过验证的菌落实施了活化。随后，我们采用两种不同温度（16℃与28℃）和两种IPTG浓度（0.05mM与1mM）的组合条件进行了诱导表达实验。在诱导表达结束后，我们收集了各组实验条件下的菌体，利用PBS缓冲液进行了洗涤。之后，我们采用超声波对菌体进行了破碎处理，具体操作为每次破碎5秒，间隔5秒，全程共计10分钟。破碎后，以12000rpm的转速进行了30分钟的离心，实现了上清液与沉淀的分离。接下来，我们分别对上清和沉淀进行了样品处理，即添加5×SDSLoadingBuffer，均匀混合后，置于沸水中加热5分钟，随后以12000rpm的速度离心10分钟。最终，我们利用SDS电泳分析结果，确定了最优的表达条件。生物活性测定将特定量的饲料进行精确称重后，放入已消毒的塑料袋中并彻底碾碎。随后，根据实验所需的蛋白质量，精确计算并加入到已碾碎的饲料中。确保混合均匀后，平均分配至一次性的无菌酱料盒中。待饲料稍微晾干后，选择大约二龄的鳞翅目昆虫加入，每个浓度组包含约10头幼虫。为确保实验结果的准确性，需设置三个重复组，并重复整个实验过程三次。同时，以清水作为空白对照组进行对照实验。对于定性实验，需要记录从第1天至第7天的昆虫死亡数量。之后，利用GraphPadprism7软件对数据进行统计分析，以获取有关昆虫死亡情况的详细信息。对于定量实验，蛋白样品需进行7个或8个梯度的稀释，稀释的浓度梯度分别为1、3/4、2/4、1/4、1/8、1/16、1/32和1/64。记录第5天或第7天的死亡数和抑制数。结果与分析Cry2A-like毒素基因的克隆从海南岛热带雨林成功分离出了一株新型的Bt菌株，并将其命名为Z149-5。接着，进行了初步的基因组测序与分析工作，结果揭示出该菌株内存在一个与Cry2A毒素基因高度相似的基因，将其命名为Cry2A-like。为了确保实验结果的准确性，将Z149-5菌株置于28℃的条件下进行了一夜的活化处理，并随后成功地提取了总DNA。琼脂糖凝胶电泳分析显示，所提取的Bt总DNA条带的大小与预期相符，且基本上未观察到杂带的干扰，这为后续的实验操作奠定了坚实的基础，提供了有力的物质支持。基于对BtZ149-5基因组开放阅读框的预测结果，精心设计了一对特异性引物，即P2_190-F/R，旨在扩增目标基因Cry2A-like。以Z149-5的总DNA作为模板，成功执行了PCR扩增。此外，为构建重组质粒，选用pET-28a质粒作为模板，并运用特定位点反向扩增引物进行了PCR线性化操作。经过梯度退火温度的测试，最终确定了65℃为Cry2A-like毒素基因扩增的最佳退火温度。在该实验条件下，我们进行了大规模的扩增操作，随后采用柱式PCR产物纯化技术对扩增产物进行了精细处理，以确保为后续实验研究提供高纯度的DNA模板。依据吐露港公司的操作指南，我们采用2×EzmaxUniversalCloneMix试剂，顺利实现了纯化的Cry2A-like毒素基因片段与线性化pET-28a载体的无缝克隆连接。随后，我们取出了10μL的连接反应产物，成功地将其转导到DH5α化学感受态细胞中。之后，我们随机选择了单个菌落进行了整夜的活化处理。在接下来的日子里，我们成功地从活化后的菌落中提取了质粒，并利用BamHI和XhoI双酶切技术对其进行了有效性验证。实验数据显示，所有被检测的单个克隆子均成功实现了连接。图3.1Z149-5基因组、Cry2A-like基因梯度PCR、质粒双酶切验证注：图A为Z149-5总DNA提取，图B为Cry2A-like基因不同温度梯度结果，泳道1~8分别为65℃、64.3℃、63℃、61.1℃、58.8℃、56.9℃、55.7℃、55℃。图C为经过整夜活化后的单克隆所提取质粒，在经过XhoI和BamHI双酶处理后的切割结果。Cry2A-like表达分析经过验证实验的确认，克隆子已被成功导入BL21(DE3)表达菌株中。之后，我们从转化后的菌落中随机选择了单个菌落进行PCR检测，确保其活化成功。紧接着，我们在两种不同的温度环境（16℃与28℃）下，分别采用0.05mM和1mM的IPTG浓度对菌落进行了诱导表达。诱导表达结束后，我们收集了在不同实验条件下的细菌样本，并用PBS缓冲液对其进行了洗涤。然后，我们运用超声波技术对细菌进行了细胞破碎，整个破碎过程持续10分钟，期间采用每破碎5秒后暂停5秒的方式循环进行。破碎工作完成后，通过12000rpm离心30分钟，成功分离了上清液与沉淀。对上清液和沉淀进行了备样处理，加入5×SDSLoadingBuffer后充分混匀，并在沸水中蒸煮5分钟。再次以12000rpm离心10分钟后，进行了SDS电泳分析，以确定最佳的表达条件。实验结果显示，在16℃、0.05mMIPTG条件下，成功表达出了大量可溶性蛋白，其中编码完整基因的表达产物分子量约为71.3kDa。图3.2Cry2A-like各条件下表达SDS电泳图示注：M:三色预染蛋白Marker;泳道1为pET-28a空载转入BL21(DE3)0.5mMIPTG诱导上清；泳道2为pET-28a空载转入BL21(DE3)0.5mMIPTG诱导沉淀；泳道3-4：分别为0.05mMIPTG在16℃、20h上清液及沉淀；泳道5-6：分别0.1mMIPTG在16℃、20h上清液及沉淀；泳道7-8：分别为0.05mMIPTG在28℃、20h上清液及沉淀；泳道9-10：分别为0.1mMIPTG在28℃、20h上清液及沉淀。Cry2A嵌合毒素的设计与克隆Cry2A嵌合毒素的设计Cry2A-like为实验室自主分离鉴定的一个新型毒素蛋白，但经生物活性测定，该毒素对小菜蛾和棉铃虫的杀虫活性并不显著。提高毒素效力以阻止或延缓昆虫抗性。在研究的过程中发现，Cry2A-like与Cry2Ab的N端结构域相同，但M端结构域和C端结构域差别很大。因此，本研究采用置换M端结构域策略来增强杀虫蛋白对昆虫的毒素效力，获取Cry2A-like与Cry2Ab的三个结构域的目的片段，通过无缝克隆交换结构域，构建了两种嵌合蛋白Cry2A-1和Cry2A-2。图3.3Cry2Ab和Cry2A-like毒素蛋白结构域进行置换Cry2A嵌合毒素的克隆为满足无缝克隆的技术要求，我们精心设计了合适的引物并成功合成。以提取的总DNA作为PCR扩增的模板，我们成功扩增得到了Cry2Ab和Cry2A-like基因的目标DNA片段。同时，我们也从表达载体pET-3中顺利提取了质粒，并通过双酶切技术获得了线性化的载体。随后，我们将线性化的pET-28a载体与Cry2Ab及Cry2A-like基因片段分别进行了无缝克隆连接，并成功地将连接产物转入了BL21(DE3)菌株中。为了确认阳性克隆子的构建是否正确，我们综合运用了PCR、酶切分析以及DNA测序等多种方法进行验证。实验结果如图展示，清晰地证明了Cry2Ab和Cry2A-like目标片段的成功扩增。更进一步的验证，包括表达子PCR、酶切分析以及测序结果，均显示实验数据与预期相符，且未发现任何特异性突变。因此，可以确信已经成功地构建了Cry2Ab和Cry2A-likeBL21(DE3)表达工程菌株，为后续研究奠定了坚实基础。图3.4Cry2Ab和Cry2A-like目的片段PCR注：M:三色预染蛋白Marker;泳道1~6分别为2A1-1、2A1-2、2A1-3、2A2-1、2A2-2、2A2-3片段Cry2A嵌合毒素的表达分析和生测Cry2A嵌合毒素的表达分析经过精心设计与构建，嵌合基因已成功导入大肠杆菌BL21(DE3)细胞内。为了进一步优化蛋白表达条件，进行了一系列实验，涵盖了不同温度、IPTG浓度和诱导时间等多个变量。经过严谨的实验验证，成功实现了Cry2A-1和Cry2A-2嵌合基因的异源表达。通过详细的比对分析，发现当温度为16℃、IPTG浓度为0.1mM、诱导培养时间为20h时，蛋白表达效果达到最佳状态。低浓度的IPTG能够有效调节蛋白表达速度，有助于蛋白质的准确折叠，进而减少包涵体蛋白质的形成，提升重组蛋白的可溶性表达REF_Ref25241\r\h[17]。图3.5Cry2A-1和Cry2A-2双酶切验证、表达SDS电泳图示注：M:三色预染蛋白Marker;左图泳道依次分别为Cry2A-1和Cry2A-2双酶切验证图；右图为Cry2A-1和Cry2A-2在0.1mMIPTG在16℃诱导表达20h条件下表达SDS电泳图；泳道1为pET-28a空载转入BL21(DE3)0.5mMIPTG诱导上清；泳道2为pET-28a空载转入BL21(DE3)0.5mMIPTG诱导沉淀；泳道3：Cry2A-1上清液；泳道4：Cry2A-1沉淀；泳道5：Cry2A-2上清液；Cry2A-2沉淀Cry2A嵌合毒素生物活性的测定除此之外，为了进一步评估可溶性毒素蛋白Cry2A-like的生物活性，还对棉铃虫和小菜蛾进行了定性的生物活性测定，将成功表达的嵌合蛋白进行室内杀虫活性测定。经过定性实验，记录从第1天至第7天的昆虫死亡数量。对于所收集的生测数据，采用了GraphPadprism7软件进行了深入的分析。根据测试结果，Cry2A-1与Cry2A-2对于所测试小菜蛾幼虫展现出明显的杀虫活性，然而未对棉铃虫展现出明显的杀虫活性。但是经过嵌合改造后，Cry2A-1、Cry2A-2明显均对所测试棉铃虫、小菜蛾幼虫的杀虫毒性效力增高。图3.5生物活性测定讨论经深入探究，Cry2类毒素作为Bt杀虫毒素，具备高序列相似性，但在杀虫特异性和杀虫谱方面存在显著差异。特别值得一提的是，部分Cry2类毒素对鳞翅目和双翅目幼虫均展现双重活性。据竞争结合实验结果显示，Cry2类蛋白与广泛运用于防治鳞翅目害虫的Cry1A、Vip3A蛋白在棉铃虫中肠并不竞争结合位点，这意味着它们之间不存在交互抗性。因此，Cry2类蛋白被视为昆虫抗性治理的重要候选蛋白。为了更全面地理解Cry2A类杀虫蛋白的作用机制，我们进行了系统的文献回顾和实验研究。经过对比分析不同Cry2A类杀虫蛋白的结构与功能，我们发现其杀虫活性与某些特定结构域紧密相连。基于此，通过结构域交换和嵌合改造Cry2A-like，有望开发出具有更高杀虫活性的新型生物杀虫剂。然而，目前关于Cry2A类杀虫蛋白的研究报道尚显不足，这在一定程度上限制了其在农业领域的应用潜力。本研究致力于通过结构域交换和修饰，对Cry2A杀虫蛋白进行深入研究，旨在解决现有问题，提高其对特定靶标昆虫的毒性效力。经过结构域交换，我们成功地将Cry2A杀虫蛋白的关键功能区域与其