DB21T 2536-2015 副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法

DB21DB21/T2536—2015副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRfortheaviumsubsp.paratuberculosis辽宁省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。1本标准规定了副结核分枝杆菌（Mycobacteriumaviumsubssp.paratuberculosis）实时荧光PCR件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用GB/T6682分析实验室用水规格和试验DEPC：焦碳酸乙二酯（DiethylTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAci实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReactiTAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现5试剂和材料2除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA5.1试剂5.1.2Triton-X-1005.1.4三氯甲烷。5.1.5柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液：配制方法见附录A.5.1.675%乙醇：配制方法见附录A.3。5.1.84%氢氧化钠：配制方法见附录A.4。5.1.94%硫酸：配制方法见附录A.）：）：制方法见附录A.9，5%甘油：配制方法见附录A.5.1.11dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)，UDG酶。5.1.12引物：以副结核F57基因序列合成一对特异性引物：上游引物5'5.2仪器与耗材5.2.1接种棒5.2.4微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL5.2.5组织匀浆器。5.3仪器与耗材6生物安全要求7.1.1培养物：直接取液体培养基培养的菌液，对于在固体培养基上生长的菌37.1.2血样：用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无7.1.4粪便：选取新鲜粪便（腹泻或或有粘液、血），7.1.5组织：选取有明显病变的肠段，回盲瓣以及病），），自上述完成前处理的样品中加入100μlDNA提取液，充分振荡混匀，55℃温浴30min，98℃加热10min，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，取上清。粪便样品进行以下步骤：加3倍体积异丙醇，颠倒混匀，放置5min；4℃15000g离心10min，弃上清，加3倍体积70%乙醇，振荡洗涤；4℃15000g离心10min，弃上清，室温干燥5min；加入50μl无DNA酶、无RNA酶），49结果判定9.1结果分析条件设定9.2质控标准9.2.3如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。9.3结果描述及判定9.3.1阴性判定无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无副Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在副结核分枝杆菌5A液(0.2mol/LNaH2PO4溶液)：称取一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·H20)27.6g,或二水合磷酸二氢钠2PO420)31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用A.2柠檬酸钠一磷酸缓冲液分别量取51mLA液、49mLB液，混合即成100mLpH6.称取2.84g柠檬酸钠(Na3C6H5O·2H2O)，加入100mLA.375％乙醇溶液量取75ml无水乙醇溶液，加入双蒸水中，充分混匀，定容至100A.44％氢氧化钠溶液称取8g氢氧化钠，加入双蒸水，充分溶解,定容至200A.54％硫酸溶液98%的浓硫酸10ml，加入双蒸水，定容至45A.650mmol/L氯化钾（50mmol/LK称取3.73g氯化钾，加入双蒸水，充分溶解，定容至1000mlA.82.5mmol/LMgCl