玉米褪绿斑驳病毒 形态学检测 透射电子显微镜法-团体标准编制说明

一、工作简况1.任务来源本标准经中国材料与试验团体标准委员会（以下简称：CSTM标准委员会）科学试验领域委员会审查，CSTM标准委员会于2022年6月批准《玉米褪绿斑驳病毒形态学检测透射电子显微镜法》立项。标准项目归口管理委员会为CSTM/FC98/TC02科学试验领域委员会科学试验创新方法技术委员会，标准计划编号为CSTMLX980200999—2022，由浙江大学牵头承担《玉米褪绿斑驳病毒形态学检测透射电子显微镜法》团体标准的制定工作。2.标准制定的背景和目的玉米褪绿斑驳病毒（Maizechloroticmottlevirus,MCMV）是侵染玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、甘蔗等禾本科作物的重要检疫性病毒病原，被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，是我国各地植物保护检疫机构严密监控的对象。该病毒多年来在各地出入境口岸时有检出，2009年在我国云南元谋县大田玉米上发生玉米致死坏死病（cornlethalnecrosis，CLN），浙江大学谢礼等运用电子显微镜观察、血清学检测和分子鉴定技术，首次报道了该病病原的鉴定结果，确定主要病原为MCMV（LiXie，2011），这是在中国境内第一次发现MCMV危害大田农作物。2015年国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会颁布了我国第一部《玉米退绿斑驳病毒检疫鉴定方法》国家标准（GB/T31810-2015），成为玉米退绿斑驳病毒检疫检测工作的规范。在这部标准中规定了基于血清学技术的双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）检测、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测等技术方法，但没有涉及到应用电子显微镜检测诊断MCMV的技术方法。病毒是自然界最小的生命形式，必须借助于透射电子显微镜才能显示其形态结构，在病毒病原的检测诊断中，往往强调“眼见为实”，形态结构是诊断病毒种类的重要依据。通常情况下运用负染色和超薄切片电镜观察就能诊断和鉴别植物病毒，一般可以诊断到属的水平，有的细胞病变特征还能帮助鉴别到病毒的种。在出入境检验检疫工作中，对于植物病毒除了需要抗体检测或分子检测的证据外，还需要病毒粒子的形态照片。即使在日常的植物病毒研究工作中，常常也需要电镜的形态学观察结果作为实验佐证。MCMV是类番茄丛矮病毒目（Tolivirales）、番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）、玉米褪绿斑驳病毒属（Machlomovirus）的唯一成员，为直径30nm的二十面体球状病毒，在玉米病株细胞内含量极高，其组织粗汁液经负染色后在透射电镜下很容易观察到。该病毒还引起细胞内过氧化物酶体和线粒体结构改变，过氧化物酶体产生周边复制小泡，线粒体囊泡化病变，在其囊泡结构中积累大量纤维状物质，随着线粒体崩解，纤维状物质释放到细胞质，是鉴别MCMV的重要细胞病理结构特征。我们自2009年起研究MCMV，先后承担了农业部公益性行业（农业）科研专项“稻麦重要病毒病株系鉴定和防控技术体系研究”，国家自然科学基金面上项目“两种二十面体植物病毒的低温电镜三维重构研究”等项目，建立了MCMV单克隆抗体ELISA快速检测方法，在国际上首次运用低温电镜研究MCMV的三维空间结构。在日常接受大田病样和入境抽检样品的过程中，发现采用透射电镜对田间玉米病样进行负染色快速检测，结合超薄切片观察组织细胞病理变化，可以准确诊断MCMV，与抗体检测结果的吻合度非常高。即使是玉米种子病毒含量较少的情况下，也可以通过免疫吸附电镜技术来富集病毒，提高病毒的检出率。在当前快递业非常发达的情况下，基层农业机构和农户可以通过快递邮寄病样到专业电镜实验室，可以较快地得到检测结果。透射电镜为大型精密仪器，技术要求较高，用透射电镜技术检测植物病毒虽然广泛应用于高等院校、科研院所、检验检疫机构，但由于各个电镜实验室技术能力的差异，在具体操作上缺少统一标准，往往造成检测结果差别很大。迄今为止还没有一个国家或者行业标准可用于规范MCMV的电镜检测分析，我们也没有查到相应的国际标准。因此，有必要先制定一部规范MCMV透射电镜形态学检测诊断的团体标准，把关键的样品前处理程序以及电镜判定标准确定下来，以保证检测结果的准确性和科学性。鉴于此，我们在长期从事植物病毒研究工作的基础上，结合我国的实际情况，提出了制定《玉米褪绿斑驳病毒形态学检测透射电子显微镜法》的计划。该标准的制定有助于规范MCMV的透射电镜检测诊断，可在高等院校、科研院所、基层企事业单位的电镜实验室宣贯推广，该标准为国内首个MCMV形态学电镜检测团体标准，具有重要的理论意义和实用价值。3.工作主要过程（1）起草阶段：在以往工作的基础上，联合云南省农业科学院、珠海市拱北海关技术中心、上海市海关动植物与食品检验检疫技术中心等单位组建成立了标准起草工作组，确定了标准编写原则和分工，提出标准编制进度安排。于2022年6月完成《玉米褪绿斑驳病毒形态学检测透射电子显微镜法》初稿，经过相关合作单位的意见征询以及部分实验补充验证，于2022年9月完成征求意见稿。（2）征求意见阶段：2022年10月通过CSTM网上系统递交《玉米褪绿斑驳病毒形态学检测透射电子显微镜法》征求意见稿和编制说明，广泛征求意见。4.主要参加单位及工作组成员主要参加单位包括：浙江大学，云南省农业科学院，珠海市拱北海关技术中心，上海市海关动植物与食品检验检疫技术中心。工作组成员包括：洪健，谢礼，王华，李云琴，尚卫娜，吴建祥、张仲凯、张卫东、于翠。二、标准化对象简要情况及制修订标准的原则1.标准化对象简要情况本标准为旨在规范本领域内各标准的制修订和发布。2.制修订标准的原则（1）制修订标准的依据或理由依据中国材料与试验团体标准制修订管理细则、中关村材料试验联盟团体标准管理办法（试行）制定本标准，规范本领域内各标准的制修订和发布。（2）制修订标准的原则本标准编制遵循经济社会发展需求原则、技术先进和经济合理原则、适应贸易全球化需求原则、维护公众利益原则、协商一致原则、广泛参与和公开透明原则。本标准在结构编写和内容编排等方面依据GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》进行编写。三、采用国际标准和国外先进标准的情况无四、标准制定的原则与主要技术内容植物病毒的透射电镜形态检测主要采用负染色技术、超薄切片技术、免疫电镜技术，这些技术方法是经过长期实践证明稳定可靠的通用性方法，所制备的植物病毒样品适用于各种型号的生物透射电镜观察。因此，我们在编制标准具体条款时，主要列举了样品制备的过程和要求，对于透射电镜，只列出了观察条件的选择原则，针对某一台仪器的具体操作步骤建议参照仪器操作说明书。在样品前处理程序中，列举了负染色技术、超薄切片技术、免疫电镜技术的基本步骤，涉及样品前处理过程所用到的制样设备如超薄切片机、玻璃制刀机、包埋聚合器、高速离心机的具体操作步骤也建议参照仪器说明书。本标准规定了应用透射电镜对玉米褪绿斑驳病毒进行形态学检测的技术要求与规范，标准适用于该病毒的检验检疫以及田间样品的形态学诊断鉴定。主要内容包括：1范围2规范性引用文件3术语和定义4原理5仪器设备、试剂和材料、环境条件6样品7检测步骤8实验数据处理9检测结果发布附录A玉米褪绿斑驳病毒相关资料附录B常用试剂配方附录C玉米褪绿斑驳病毒电镜照片附录D起草单位和主要起草人五、试验验证分析1.负染色电镜观察：将采自云南呈明显症状的玉米病叶剪碎，在研钵中加0.05mol/L磷酸缓冲液研磨后用覆Formvar膜的电镜铜网蘸取组织粗汁液，经2%磷钨酸（pH6.7）负染色。将带病毒的种子种皮加磷酸缓冲液研磨后，经2%磷钨酸（pH6.7）负染色。 2.免疫吸附电镜观察：将铜网膜面朝下放置于1:10~1:100倍稀释的MCMV抗体抗体液滴上保湿孵育15min，用20滴0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH值7.0）滴洗铜网，洗除多余抗体。用滤纸片吸掉余液后，将铜网放置于病毒样品悬液滴上保湿孵育30min（如种子的病毒含量低，反应时间可延长至数小时或过夜）。用20滴0.05mol/L的磷酸缓冲液、30滴双蒸馏水先后连续滴洗样品铜网，吸除余液后以2%磷钨酸（pH值6.8）负染色。3.超薄切片电镜观察：取病叶退绿黄化边缘部位切成2mm×4mm小片，用0.1mol/L磷酸缓冲液配置的2.5%戊二醛和1%四氧化锇双重固定，乙醇梯度脱水，丙酮替代，Supper’树脂包埋，在德国LeicaUC7型超薄切片上用钻石刀切成70nm厚的超薄切片，柠檬酸铅和醋酸双氧铀双重染色。上述样品均在日立HitachiH-7650型透射电镜下观察，加速电压为80kV，用美国Gatan832型CCD相机记录图像。4.观察结果分析：（1）田间症状：云南大田玉米新叶出现褪绿、黄绿色的症状，随着病害的发展，叶片上高密度的褪绿斑点非常显著；成株期发病植株比正常植株矮小，生长缓慢，节间短植株明显矮化，严重受害植株不能抽穗和结苞，大部分叶片枯萎。图1.大田玉米感染MCMV的发病状况图2.感染MCMV玉米病株叶片退绿症状（2）负染色和免疫吸附电镜观察结果：感染MCMV的玉米病叶或种子研磨得到的粗汁液经负染色或免疫吸附后负染色，在透射电镜下观察到许多球状病毒粒子，直径约为30nm左右，同时还能观察到复合侵染的线状病毒粒子。图3.玉米病叶粗汁液中的MCMV粒子图4.粗提纯的MCMV粒子（3）超薄切片电镜观察结果：在MCMV感染的病变细胞中可以观察到大量球状病毒粒子分散在细胞质内，还有结晶状排列的病毒聚集体；过氧化物酶体增生并聚集，形成周边复制小泡；线粒体呈现囊泡化病变，在由线粒体内脊形变而成的囊泡结构中积累了大量纤维状物质，后期线粒体崩解。图5.玉米病叶细胞质中散布的MCMV粒子图6.细胞质中的MCMV粒子形成结晶图7.过氧化物酶体聚集并形成周边复制小泡；图8.过氧化物酶体的周边复制小泡图9.细胞质中的线粒体囊泡化病变图10.细胞质中解体的线粒体及纤维状物六、与有关的现行的方针、政策、法律、法规和强制性标准的关系本标准与我国现行法律、法规无矛盾、抵触之处。七、对征求意见及重大分歧意见的处理经过和依据该标准的编制过程中，无重大分歧意见。八、标准水平建议，预期的社会经济效果建立一套针对玉米退绿斑驳病毒形态学电镜检测的制样方法和电镜检测标准规程，满足全国农业相关的分析测试机构、高等院校及科研院所研究机构对该病毒的检测研究需要。本标准制定后，将在我国种植玉米的病毒病检测鉴定中作为检测依据而广泛采用；同时，全国出入境检验检疫机构也将在进口玉米的检验检疫采用本标准，与现有国家标准（GB/T31810-2015）所规定的抗体检测、RT-PCR检测技术形成相互补充的完善检测规程体系。对于我国社会进步和国民经济发展具有重要意义。九、贯彻标准的要求和措施建议建议