物理方法诱导细胞融合的进展

物理方法诱导细胞融合的进展一.细胞融合简介二.传统物理融合方法三.其他物理融和方法细胞融合技术是近年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术，在外力（诱导剂或促融剂）作用下，2个或2个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合，并形成杂种细胞的现象称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交。(cellhybridization)它是利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成1个细胞，这个新细胞（杂合细胞）得到了来自2个细胞的遗传物质（包括细胞核的染色体组合和核外基因），将具有新的遗传学或生物学特性。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。

细胞融合方法有生物法、化学法和物理法，其中生物方法因病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室。化学法因为存在对细胞损伤大、残存毒性、融合率较低及经验性大等缺陷，目前应用也不广。而物理方法因融合频率高，是PEG的100倍；操作简便、快速；对细胞无毒；可在镜下观察融合过程

等优点，显示出强大的生命力。

二.传统物理方法1.电融合法2.激光融合法1.电融合法

电融合诱导法是指利用电场来诱导细胞彼此连接成串，在施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促使细胞融合的方法。

自从1978年Zimmermann首先采用电脉冲方法成功地诱导了细胞电穿孔、电融合以来近三十年里,电穿孔和电融合技术不断发展完善成为一门比较成熟的学科,得到非常广泛地应用。

1983～1988年期间,以Zimmermann为主的工作小组通过动物、植物和微生物细胞电融合实验得出高频短脉冲是可行的。并且认为高频短脉冲电信号可以用于细胞操控、基因工程和细胞融合,证明了利用电场这一物理因素诱导细胞融合具有普遍的适用性。由于电融合的可控性,使人们第一次在显微镜下直接观察细胞的融合过程,且电极间细胞的融合率高达10～80%。

1991年Naton等提出利用融合对象间密度的差异来实现融合时的有序队列。在两电极间放入合适密度的媒质,混合的两种类型的原生质体就会形成两个不同的单层结构;在此情况下,可以获得很高的异核融合产率。融合率取决于所加电场的方向,如果接触区域是建立在阳极面,那么融合率就会比建立在阴极面提高两倍。他们采用的实验样本是美洲狼尾草叶肉细胞和烟草叶肉细胞的原生质体。

1993年俄罗斯研究人员Abidor等采用了一种新的方式来研究细胞融合和高电场中细胞膜的电学特性。他们将L929细胞和其它的四种类型细胞的悬浮液放入特殊的腔室中,通过离心力作用将细胞紧压同时所测量紧压体系的电阻值间接地发映出离心过程中状态的变化情况,并通过对比试验揭示出膜接触程度的近与远是影响细胞融合率高与低的关键因素。

2000年Mekid等首次报道了电场作用下组织中发生细胞电融合过程,他们采用B16鼠科黑素瘤组织,在不施加和施加500V/cm,1350V/cm,2000V/cm等不同场强条件下,得到了电融合后的细胞并通过相互对比得出高场强作用下融合过程比较明显的实验结果。虽然此时细胞融合率已经比较高,但是电极间距离仍然属于毫米级,所以在进行细胞电融合时,电压必须提高到300V以上才能够达到细胞电融合所需的电场强度。此外,融合装置体积比较大但是细胞融合通量较低,这些不利因素都限制了细胞电融合的推广。

2004年日本东京大学的研究人员采用硅电极、玻璃与PDMS相结合的微流控芯片制作出了高纵横比的电极,并且采用低电压技术实现了高效的细胞融合,融合率达到75%。

2007年Jongil等在“芯片实验室”水平上通过电融合手段,实现了对日本美口菌和珊瑚菜的电融合过程。他们的芯片是由玻璃作为基底,PDMS通过铸模方式实现微流控通道的制作然后利用等离子键合使上下两层紧密结合,很大程度上提高了细胞1:1的对准并发生融合的概率。在交流电压1～2MHz峰峰值8～10V的矩形脉冲作用下实现排队过程;然后采用周期为10～100毫秒幅值为250mV的直流脉冲来控制和保持融合。此外,该课题组对电极电场分布进行了仿真。同年Wang等采用微流控电穿孔技术,制造了PDMS弹性阀。当施加直流电压脉冲时,PDMS阀能够实现快速关断产生电压脉冲序列。在此条件下的细胞融合芯片中的细胞,能够进行排队及融合。而且此技术解决了制造电极和高电压脉冲电源的难度问题。

2.激光融合法

20世纪80年代中期又发明了激光融合器,迅速崛起的激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动),可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触,然后对接触处进行脉冲激光束处理,使质膜发生光击穿,产生微米级的微孔。这样,由于质膜上微孔的可逆性,细胞开始变形融合,最终成为一个细胞。

1987年和1989年德国海德堡理化研究所用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟,对融合产物观测,发现胞质仍在运动,说明融合后的细胞仍能存活。激光微束融合法与以前的病毒法、PEG法、电融合法相比较,可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时、定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌,无毒性。

但它只能逐一处理细胞,不能像其他方法一样同时处理大量细胞。细胞间相互接触是实现细胞融合的前提,目前,最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触,即光镊(poticaltweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间,在光斑直径与光波波长尺度相比拟时,指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力,该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处,从而实现对细胞的操作。

缺点三现代物理方法1.基于微流控芯片的细胞融合技术

2.高通量细胞融合芯片

3.空间细胞融合技术

4.离子束细胞融合技术

5.非对称细胞融合技术

1.基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统（MEMS）技术和微加工技术的发展，微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域。利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，比如转移、定位、变形等，也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞，细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。此外由于在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

2.高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在微米范围内（10-40微米）产生的高强度、高梯度辐射电场，使得细胞在特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的目标细胞，从而使目标细胞按照预先设计的方向（可以是任何预先设计好的方向）以预定的速度（可以是不同种的细胞以不同的速度定向）移动，从而按照设计要求准确地、大批量地得到目标细胞配型，集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。由于在微通道内微电极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲即可，不用加载昂贵的高电压发生装置。高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合，比如：在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率。此外，二价阳离子（例如：钙离子）以及蛋白酶对细胞进行预处理，融合率也可大幅提高。然而，截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇文章见诸报端，许多构想也只是在理论层次上的探讨。3.空间细胞融合技术

由于地球引力的存在，有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞间的融合得率十分有限。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，由于无法排除地球引力的影响，要提高淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。20世纪80年代以来，人们在空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。大量的飞行实验结果表明，在微重力条件下酵母细胞的融合得率有很大的增加，融合得率增加主要是由于降低了重力沉降影响，而杂种细胞的活力增加可能是由细胞排列时间缩短引起的。在取得这些成功实验的基础上，进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经具备。

4.离子束细胞融合技术

雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80年代中期，中国科学院等离子体物理研究所的余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变。据此原理，发展了离子束诱导细胞融合技术。此项研究改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛选的工作量，将是细胞融合研究的一大进步。

5.非对称细胞融合技术

非对称细胞融合技术，是利用某种外界因素-常为γ射线，即γ融合.辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核，并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体，选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这2个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。

实践表明，非对称细胞融合技术通过γ射线照射，为实现供体亲本少数基因的转移，创造种间、属间杂种，提供了可能性。值得注意的是，此方法特别适用于细胞质雄性不