实验四血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

【实验目的】掌握电泳法分离血清蛋白质的原理掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义12/8/20241当前1页，共38页，星期日。电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术【实验原理】12/8/20242当前2页，共38页，星期日。H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI12/8/20243当前3页，共38页，星期日。电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即

V—粒子运动的速度X—电场强度Q—粒子所带电荷r—粒子的半径η—介质的粘度12/8/20244当前4页，共38页，星期日。影响电泳速度的因素1.样品本身：分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦越小，u越大。球形分子>纤维状分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；12/8/20245当前5页，共38页，星期日。2.缓冲溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大离子强度(I)：I越大，电动电势越小，u越小；I越小，电动电势越大，u越大，但样品易扩散。离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02～0.2之间。12/8/20246当前6页，共38页，星期日。电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。3.电场强度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离12/8/20247当前7页，共38页，星期日。4.支持介质：①纤维薄膜(玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜)②凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶)12/8/20248当前8页，共38页，星期日。负极正极－－－－－－－－表面带负电荷带正电荷的水层携带粒子向负极移动

如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。电渗作用：电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。＋＋＋＋＋＋＋＋以纸电泳为例:12/8/20249当前9页，共38页，星期日。区带电泳的分类（一）支持物物理性状1．滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维薄膜)电泳2．粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；3．凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；4．丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。12/8/202410当前10页，共38页，星期日。（二）支持物装置形式：1．平板式电泳：支持物水平放置；2．垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳12/8/202411当前11页，共38页，星期日。(三)pH连续性：1．连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2．非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等12/8/202412当前12页，共38页，星期日。醋酸纤维薄膜为支持物pH=8.6的巴比妥缓冲液血清蛋白的pI均小于8.6负电荷电泳时向正极移动由于迁移率不同而被分离12/8/202413当前13页，共38页，星期日。当前25页，共38页，星期日。打开电源开关，调节电流强度为0.当前9页，共38页，星期日。绘出电泳图谱并标明各条带含义②凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶)可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上临床上还可用A/G比来表示清球蛋白的量的关系：当前31页，共38页，星期日。当前32页，共38页，星期日。1．连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。盖电泳槽盖，平衡10min点样端薄膜平贴阴极电泳槽支架滤纸桥(点样面朝下)当前23页，共38页，星期日。选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.γβα2α1清蛋白分子越小，泳动速度越快带电量越多，泳动速度越快12/8/202414当前14页，共38页，星期日。膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。2.定性,定量各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。12/8/202415当前15页，共38页，星期日。醋酸纤维薄膜：醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析血清蛋白、血红蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、类固醇及同工酶等12/8/202416当前16页，共38页，星期日。优点：简单快速缺点分辨率较低（聚丙烯酰胺凝胶电泳，PAGE）不适于制备（薄膜厚度约10～100μm，样品用量很少）12/8/202417当前17页，共38页，星期日。【器材及试剂】1、器材：醋酸纤维薄膜（2×8cm）常压电泳仪竹镊点样器人血清或鸡血清粗滤纸2、试剂：巴比妥缓冲液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液12/8/202418当前18页，共38页，星期日。5mA/片，电泳60~90min绘出电泳图谱并标明各条带含义当前18页，共38页，星期日。Q—粒子所带电荷r—粒子的半径调节血浆pH值，维持酸碱平衡注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.合成原料不足：饥饿，腹泻，肿瘤晚期早期：选择性蛋白尿，Mw较小蛋白质丢失，含量下降。甲胎蛋白、类固醇及同工酶等实验的关键，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节当前23页，共38页，星期日。盖电泳槽盖，平衡10min取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min带电量越多，泳动速度越快[操作]（一）仪器与薄膜的准备1、醋酸纤维素薄膜的润湿与选择2.电泳槽的准备3、电极槽的平衡12/8/202419当前19页，共38页，星期日。（二）点样取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上点样区距阴极端1.5cm血清均匀涂在点样器表面将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内形成一定宽度、粗细均匀的直线

实验的关键，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节12/8/202420当前20页，共38页，星期日。（三）电泳点样端薄膜平贴阴极电泳槽支架滤纸桥(点样面朝下)

另一端平贴在阳极端支架

要求：薄膜紧贴滤纸桥并绷直，薄膜之间相隔几毫米盖电泳槽盖，平衡10min打开电源开关，调节电流强度为0.3mA/片，通电10min调节电流强度为0.5mA/片，电泳60~90min

电泳后调节旋钮电流为O，关闭电泳仪切断电源12/8/202421当前21页，共38页，星期日。DYY-5型稳压稳流电泳仪DYY-Ⅲ型电泳槽12/8/202422当前22页，共38页，星期日。12/8/202423当前23页，共38页，星期日。离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定不适于制备（薄膜厚度约10～100μm，样品用量很少）取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5minγβα2α1血清蛋白、血红蛋白、球蛋白当前3页，共38页，星期日。分子越小，泳动速度越快取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳调节血浆pH值，维持酸碱平衡2．粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；②凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶)绘出电泳图谱并标明各条带含义选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.3mA/片，通电10min12/8/202424当前24页，共38页，星期日。【实验注意事项】不要用手触摸纤维素膜注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘太近不要重复点样膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极12/8/202425当前25页，共38页，星期日。用点样器点样时不要点的太多，但也不能太少线条均匀，用力水平。电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液12/8/202426当前26页，共38页，星期日。（四）染色和漂洗取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min自来水冲洗，漂洗液漂洗更换3次漂洗液，脱去颜色，得到色带清晰的电泳图谱12/8/202427当前27页，共38页，星期日。【实验结果】绘出电泳图谱并标明各条带含义12/8/202428当前28页，共38页，星期日。12/8/202429当前29页，共38页，星期日。临床意义血浆蛋白是血浆最主要的固体成分，含量60～80g/L绝大部分由肝脏合成，仅γ球蛋白由浆细胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％γ球蛋白12％—20％12/8/202430当前30页，共38页，星期日。可能相关疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*肾病综合症↓↑*↑*肾炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝坏死↓*↑↑↑↑传染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎症/感染后期↑*低

球蛋白血症↓*临床上还可用A/G比来表示清球蛋白的量的关系：正常人A/G＝1.5～2.512/8/202431当前31页，共38页，星期日。血浆蛋白的主要功能维持血浆胶体渗透压调节血浆pH值，维持酸碱平衡运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等免疫作用12/8/202432当前32页，共38页，星期日。白蛋白降低：

合成能力不足：肝功能下降

合成原料不足：饥饿，腹泻，肿瘤晚期

去路增加：肾病综合症，严重烧伤，大出血等

消耗过多：糖尿病，甲亢等12/8/202433当前33页，共38页，星期日。球蛋白增加：感染，多发性骨髓瘤，自身免疫性疾病等球蛋白降低：皮质功能亢进，免疫缺陷病12/8/202434当前34页，共38页，星期日。肝病：A,α2-G,β-G,α1-G,γ-G，A/G下降甚至倒置肾病：早期：选择性蛋白尿，Mw较小蛋白质丢失，含量下降。如白蛋白后期：非选择性蛋白尿，Mw较小的蛋白质丢失，含量下降分子量较大的蛋白质（如γ-球蛋白）丢失，含量下降12/8/202435当前35页，共38页，星期日。【实验思考】1．电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？2．电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种成分？请分析原因12/8/202436当前36页，共38页，星期日。【常见问题及原因】1.电泳图谱不齐