版微生物限度检查法课件

05版微生物限度检查法中国药典2005版微生物限度检查法

05版微生物限度检查法

中国药典2005版微生物限度检查法在检查项目、格式、语言表述等方面都有较多的增定和修订。增订中主要的有四项：一是三菌数测定的方法验证；二是控制菌检查的方法验证；三是大肠菌群检查法；四是梭菌检查法。05版微生物限度检查法前言●微生物限度检查在环境的洁净度10000级和局部100级的单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法》现行标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

05版微生物限度检查法●培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法（见附录

XVII）的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。培养温度细菌和控制菌的培养温度未改动。霉菌和酵母菌的培养温度20~25℃改为23~28℃。灭菌和培养温度

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一般随机抽样不少于检验用量（2个以上最小包装）的3倍量。●检验量指供试品一次检验的用量。一般为10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品其检验量增加10g或10ml。检验量05版微生物限度检查法●供试液的制备用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备供试液或选用适宜的乳化剂、分散剂、中和剂制备供试液；其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。供试液制备妥后不得超过1h就加入检验用培养基。

05版微生物限度检查法非水溶性供试品①供试品5g，司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80●②供试品10g，20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠，必要时再加适量十四烷酸异丙酯，充分振摇，使供试品溶解。然后加45℃100mlpH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液，振摇5-10分钟，萃取，待油水分层后，水层过滤，贴膜培养。7类供试品供试液的制备，其中增订：05版微生物限度检查法●非水溶性膜剂供试品化学药膜剂取100cm2，剪碎，加100mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液。一部中药膜剂取50cm2，剪碎，适量的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（50或100ml）浸泡，振摇，以供试品浸液为供试液。（SOP2000版规定:中药膜剂取30~50cm2

，剪碎，加水100ml）。●肠溶及结肠溶制剂供试品10g，加100mlpH6.8无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠制剂）,于45℃水浴振摇，使溶解。

05版微生物限度检查法●气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冷冻室冷冻1h，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥钻一小孔，放置室温并轻轻转动容器，使抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-80液），使均匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10的供试液。05版微生物限度检查法

具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌活性消除后，方能依法检查。常用的方法有：

①培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级2ml供试液等量分注多个平皿，按浇碟法操作，培养、计数。每1ml供试液所注各平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数，取平均菌落数乘以稀释倍数的值按菌数报告规则报告菌数。控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。05版微生物限度检查法

②离心沉淀集菌法

取规定量的供试液，3000转/分离心20min（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5min，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。

③薄膜过滤法采用开放式薄膜过滤器。

④中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释剂或培养基中。05版微生物限度检查法

对药品进行微生物限度检查法时，首先应进行检测方法的验证。如细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认该计数方法是否科学、准确、客观。若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备，细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。细菌、霉菌及酵母菌计数增订计数方法的验证05版微生物限度检查法

菌株大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽孢杆菌、CMCC（B）63501白色念株菌CMCC(F)98001、黑曲霉菌CMCC(F)98003。菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、黑曲霉接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间，培养。取培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1ml含50~100cfu的菌液。

验证用菌株及菌液的制备05版微生物限度检查法

试验组

取规定量最低稀释级的供试液1ml，和50~100cfu试验菌，每株菌做2个平板，按平板菌落计数方法测定其菌数。采用薄膜过滤法计数时，最后一次冲洗液中加入50-100cfu，过滤，培养，计数。

菌液组测定加入的试验菌液的菌数。

供试品对照组取规定量的供试液，按平板法测定供试品稀释液本底的菌数。

稀释剂对照组取稀释液，加入试验菌，使菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。

验证方法

05版微生物限度检查法试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数–供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%

稀释剂对照组的菌回收率=[（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）]×100%05版微生物限度检查法

结果判断在三次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌和酵母菌数；若任一次平行试验中试验组的菌回收率均小于70%，不符号验证试验，应采用培养基稀释法、离心集菌法、过滤法、中和法等方法或这些方法联合使用消除供试品抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。05版微生物限度检查法2.检查法

（1）平皿法增订阴性对照试验取试验用的稀释剂1ml，于无菌平皿中，注培养基，凝固，培养。每种计数培养基各做2个平板，均不得长菌。修订细菌、霉菌和酵母菌计数的培养时间。细菌一般48h，真菌72h；必要时，可适当延长培养时间5-7d。（细菌培养时间USP48-72h，Ep5d；真菌培养时间USP5-7d，EP5d。平皿法；平皿法和涂抹法）

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在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计霉菌、酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果报告。05版微生物限度检查法细菌数30~300，霉菌数30~100。①当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。菌数报告规则05版微生物限度检查法当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。05版微生物限度检查法③当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。④各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。05版微生物限度检查法（2）薄膜过滤法。取相当于1g或1ml供试品的供试液，加至100ml稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。05版微生物限度检查法

阴性对照试验取试验用的稀释剂2ml同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。目的：检验稀释剂或冲洗液、吸管、滤器、培养基、环境和操作技术是否符合无菌性要求。

培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不多于100个。菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若最低稀释级的滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数（1g或1ml供试品/滤膜），或1＜乘以稀释倍数的值报告菌数。

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控制菌检查

1.方法的验证

对供试品进行控制菌检查时，应对检查法的科学、准确性进行验证，以确认所采用的方法是否适合该药品的控制菌检查。若药品的组分或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，检查法应重新验证。验证时按各品种项下微生物限度规定控制菌选择相应菌株验证，验证大肠菌群检查法时，应用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。05版微生物限度检查法

菌株大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094、铜绿假单胞菌CMCC（B）10104、生孢梭菌CMCC（B）64941。

菌液制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种营养肉汤、生孢梭菌新鲜培养物接种硫乙醇酸盐流体培养基，培养18~24h，取培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml含10~100cfu。验证方法①试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取供试液，过滤、冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入增菌培养基中。05版微生物限度检查法

②阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。结果判定阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。05版微生物限度检查法

2.检查法供试品的控制菌应按已验证的方法进行控制菌检查，增菌培养基的实际用量同“方法的验证”。

阳性对照试验供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。

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控制菌检查的步骤：取供试液接种增菌培养基，增菌、分离培养，革兰染色、生化试验等基本未变动，仅一些控制菌保留了前几项主要生化鉴别试验，删去了一些生化鉴别方法，这样的删节、简写，主要是节省篇幅。并不是删去，可以不做。如有可疑菌落，应进行分离、纯化、革兰染色镜检和适宜的生化试验，确认是否是要检查的控制菌。05版微生物限度检查法

大肠埃希菌

取供试液10ml直接或处理后接种至100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延至48小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

05版微生物限度检查法如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。（ChP、BP、USP）05版微生物限度检查法大肠菌群菌落形态特征菌落疑似者再进行确证试验菌落接种到胆盐乳糖发酵管，产酸产气报告检出大肠菌群，否则判未检出培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。麦康凯琼脂呈鲜桃红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。05版微生物限度检查法大肠埃希菌在EMB、MAC上的特征05版微生物限度检查法

生化试验05版微生物限度检查法

沙门菌修订

取供试品10g或10ml加至200ml的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，为试验组。取10ml稀释液加至200ml营养肉汤培养基中，为阴性对照组。培养18~24h，阴性对照应无菌生长。取上述培养物1ml，接种四硫磺酸钠亮绿培养基，培养后，划线分离胆盐硫乳琼脂（或SS）或MacC(或EMB)培养基平板，培养18～24h（必要时延长至40～48h）。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表中所列的特征，判供试品未检出沙门菌。05版微生物限度检查法若平板上生长的菌落特征与表中所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种培养18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。（ChP、BP、USP）05版微生物限度检查法增菌培养预增菌取营养肉汤培养基3瓶，每瓶各100ml，2瓶加入1：10供试液各10ml，其中1瓶加入对照菌液0.1ml(含菌量为50～100个cfu/ml)作阳性对照，第3瓶加入稀释剂10ml作阴性对照，培养18～24h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长，否则试验无效增菌培养轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照培养瓶，分别吸取1ml各接种于1管四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24h。阳性对照管应呈现混浊05版微生物限度检查法分离培养轻微摇动供试品增菌培养瓶和阳性对照增菌培养瓶，以接种环分别沾取1～2环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝(EMB)琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24～48h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落05版微生物限度检查法沙门菌在分离平板上的菌落形态特征见表平板沙门菌属亚属ⅠⅡⅣⅤ沙门菌亚属Ⅲ胆盐硫乳琼脂(DHL)无色或微带橙色，透明或半透明，边缘整齐、光滑、中等大小或较小，产H2S的菌落中心或几乎全黑色发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，中心带黑色，迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株菌落与亚属ⅠⅡⅣⅤ同沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)无色或微带粉色，透明或半透明，边缘整齐、光滑，中等大小或较小，产H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多数菌落无黑色中心同胆盐硫乳琼脂平板。但发酵乳糖无黑色中心的菌落与大肠埃希菌不能区别曙红亚甲蓝琼脂(EMB)无色或微带橙色，透明或半透明，中等大小，边缘整齐光滑发酵乳糖的菌株菌落为紫色。迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属ⅠⅡⅣⅤ同麦康凯琼脂(MacC)同曙红亚甲蓝琼脂平板发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属ⅠⅡⅣⅤ同05版微生物限度检查法菌落特征补充由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显在SS琼脂平板上，H2S特征有时不明显，沙门菌属亚属Ⅲ因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分影响后再行检查由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别05版微生物限度检查法菌落与结果报告如阳性对照平板有典型菌落生长，供试品平板均未生长或无疑似菌落生长，则报告1g或1ml供试品未检出沙门菌05版微生物限度检查法菌落传纯从每个供试品的分离平板上挑取2～3个疑似菌落(无色或微带橙色，产H2S的菌落；无色或微带橙色、不产H2S的菌落；红色，产H2S的菌落)分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面（或者克氏双糖铁琼脂斜面，制备可以查阅相关工具书）并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养24±2h，观察结果05版微生物限度检查法三糖铁琼脂反应疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应①斜面红色(产碱)，底层黑色(产H2S)并显示黄色(产酸)；②斜面红色，底层黄色；③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。05版微生物限度检查法05版微生物限度检查法脲酶试验用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养4及24h，观察结果。红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应，与变形杆菌相区别05版微生物限度检查法

赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24～48h观察结果。对照管黄色(产酸)，试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱)；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应05版微生物限度检查法

动力试验用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h，观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象；无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状；无动力表现的培养物，应在室温保留2～3天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动05版微生物限度检查法

靛基质试验用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检查法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应05版微生物限度检查法

血清学凝集试验05版微生物限度检查法

凝集反应的观察将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min，再观察结果05版微生物限度检查法

凝集试验的结果判定如试验及对照试验均出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验当培养物与0多价1血清未出现凝集现象时，应以接种环取上述斜面培养物，置于含少量0.9%无菌氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷后再以此处理后的菌悬液与沙门菌0多价1血清按上法作凝集试验。如出现凝集，仍判为阳性反应；如不出现凝集现象，则为阴性反应05版微生物限度检查法

铜绿假单胞菌

胆盐乳糖培养基增菌，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24h。特征性菌落，纯培养，革兰染色，镜检及氧化酶试验，绿脓菌素试验。若疑似菌为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试。若氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。05版微生物限度检查法金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)

取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基培养18~24h，必要时可延至48h的培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～72h。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24h。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24h，作血浆凝固酶试验。05版微生物限度检查法增订大肠菌群和梭菌检查法。大肠菌群（Coliform或Coliformbacteria）

作为水质粪便污染的指示菌已有80多年的历史。大肠菌群是指在37℃生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌。符合上述定义的细菌除大肠埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。大肠菌群基本上包括了正常人畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌更具代表性，且存活时间较长。故检出大肠埃希菌，一般认为药品受粪便的近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受粪便的近期或远期污染。以大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量05版微生物限度检查法

大肠埃希菌属枸橼酸菌属克雷伯菌属肠杆菌属ⅠⅡⅢⅣⅠⅡⅠⅡⅢⅣⅠⅡI+-+--+-+---+M++++++------V-P------++++++C----++++-+++H2S------------乳糖（44℃）+--+-----+--大肠菌群分类05版微生物限度检查法1.肠杆菌中能迅速发酵乳糖产气的4类细菌，只有大肠埃希菌才能代表人和动物粪便的污染。样本中捡出大肠菌群时，还得确认是否是大肠埃希菌。直接检查E.coli，一步到位。64年我国食品卫生亦采用检查大肠埃希菌，一步到位。但多数采取检查大肠菌群，然后确定是否是粪便来源，二步到位。2.检查大肠菌群乳糖发酵的4类菌，其卫生学意义是相同的，都是来自人和动物的粪便污染，检查大肠菌群即可。WHO50年来一贯的方法，在大多数国家推行。为了与国际接轨，我国74年开始采用国际通用的大肠菌群检查法。3.只要是发酵型的细菌，便可认为是大肠菌群。采用葡萄糖发酵试验检测，包括了肠杆菌科所有的细菌。前苏联20世纪50年代引入我国，一直沿用到20世纪60年代初期。05版微生物限度检查法大肠菌群检查方法

1.食品卫生国标方法初发酵，3管或5管胆盐乳糖培养基，产酸产气；EMB分离培养，挑选多个可疑菌落，复发酵确证，报告MPN。

2.WHO假定试验，MacC肉汤或乳糖胰胨肉汤，产气，假定阳性；不产气，再培养24h，产气，假定阳性假定阴性；不产气，假定阴性。证实试验阳性管接种煌绿乳糖胆盐肉汤2管，1管37℃48h，产气，报告检出大肠菌群。1管44℃24h，产气，报告检出耐热大肠菌群

05版微生物限度检查法

大肠菌群的检查方法是成熟的，在食品大肠菌群检查中已广泛使用。但药品不同于食品，有些药品有抑菌作用，因此在药品中检查大肠菌群，必须采用适当的方法对供试品进行处理，消除其抑菌作用后方可检查。同时从方法学的可信度考虑，应设阳性对照和阴性对照。因此，推荐的大肠菌群检查法是经过大量考察验证、准确可靠、简便易行的方法。初步考察结果表明，大肠菌群的检出率远高于大肠埃希菌，粪大肠菌群的检出率为零。不难看出，以大肠菌群作为口服药品的控制菌较为合理，更具实际意义。05版微生物限度检查法

取乳糖胆盐发酵管3支，分别加入1：10供试液1ml(供试品量0.1g或0.1ml)，1：100供试液1ml(供试品0.01g或0.01ml)，1：1000供试液1ml(供试品0.001g或0.001ml)。另取1支乳糖胆盐发酵管，加1ml稀释剂，作阴性对照。各管置36±1℃培养18~24h，阴性对照应无菌生长。

05版微生物限度检查法

乳糖胆盐发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气（或产酸不产气），报告供试品未检出大肠菌群；如有产酸产气者，应将产酸产气的发酵管分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上，培养18～24h，。如平板上无菌落生长，或有菌落生长但不发酵乳糖、非革兰阴性无芽孢杆菌的菌落，判该管未检出大肠菌群；如平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，为革兰阴性无芽孢杆菌的菌落，应做确证试验。05版微生物限度检查法05版微生物限度检查法确证试验

取上述平板上的可疑菌落4～5个，各接种1支乳糖发酵管，培养24～48h。凡产酸产气、革兰阴性无芽孢杆菌判该管检出大肠菌群。反之，判该管未检出大肠菌群。根椐检出大肠菌群的管数，按表2报告供试品每1g或1ml的大肠菌群数。05版微生物限度检查法05版微生物限度检查法

梭菌（Clostridium）

取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml）2份，其中1份置80℃保温10min后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接至100ml的0.1%新鲜庖肉培养基中。阴性对照加入的稀释剂为10ml。各培养基管在厌氧条件下培养72～96小时。如试验管不出现混浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培养物0.2ml，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养48～72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。05版微生物限度检查法

过氧化氢酶试验取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。05版微生物限度检查法

结果判断原规定5条，删去了1条。这4条的先后顺序做了调整，突出重点。供试品若检出控制菌或其他致病菌，按一次检出为准，不再抽样复试。

3种菌数任一项不合格，应从同一批样品中随机抽样，复试2次，以3次结果均值报告。眼科用药的霉菌和酵母菌菌数复试报告，须以2次复试结果均不得长菌，方可判供试品不合格。

3种菌数和控制菌任一项不合格，判该供试品不符合规定。删去了在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数多的培养基中的菌数判断结果。

05版微生物限度检查法●培养基增订乳糖胆盐发酵培养基，乳糖发酵培养基；庖肉培养基，0.1%葡萄糖庖肉培养基，哥伦比亚琼脂培养基。原培养基中的错别字已订正。●试药一部增订11种；二部增订7种。●试液增订4种。●稀释剂增订2种。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无菌聚山梨酯80氯化钠-蛋白胨缓冲液。05版微生物限度检查法

名词统一

震荡-振摇、三角瓶-锥形瓶、大肠杆菌-大肠埃希菌、绿脓杆菌-铜绿假单胞菌、破伤风杆菌-破伤风梭菌、混匀-摇匀、平皿-平板、菌苔-新鲜菌苔、生药-药材、革兰氏染色-革兰染色、沙门氏菌-沙门菌、……

05版微生物限度检查法中国药典2005版

微生物限度标准

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径、对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、储存、销售及新药标准制订、进口药品标准复核、考察药品质量、仲裁、原料及辅料等检验中，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。05版微生物限度检查法中国药典2005版一部

微生物限度标准

1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。2.口服制剂2.1不含药材原粉的制剂细菌数1g不得过103个。1ml不得过102个；霉菌和酵母菌数1g或1ml不得过102个；大肠埃希菌1g或1ml不得检出。2.2含药材原粉的制剂细菌数1g不得过104个（丸剂1g不得过3×104个）；1ml不得过5×102个；霉菌和酵母菌数1g或1ml不得过102个；大肠埃希菌1g或1ml不得检出；大肠菌群数1g小于102个，1ml小于10个。2.3含豆豉、神曲等发酵成分的制剂细菌数1g不得过105个。1ml不得过103个；霉菌和酵母菌数1g不得过5×102个。1ml不得过