分子标记技术及其应用毕业论

分子标记技术及其在植物中的应用周军

教授一、分子标记概述标记:标志，记号。遗传标记:具有遗传特性的标记。遗传标记:基因型的特殊的易于识别的表现形式。其最基本的两个特性是:可遗传性。可识别性（多态性）。遗传标记是研究遗传现象和物种进化的不可缺少的工具。遗传标记的主要种类形态学标记；细胞学标记；生化标记；分子标记（建立在某些大分子物质多态性基础上的一类遗传标记）。狭义上,仅指以DNA为基础的分子标记。广义上,还包括同工酶（等位酶）。DNA分子标记:是一种小的DNA片段，其分子量通常只有几十～几千bp（碱基对），相对于庞大的基因组（几亿～几十亿bp）而言，实在是很微小（小有小的好处）。多数情况下，DNA分子标记并不是基因或基因的一部分，而是与基因有连锁关系的一个小片段。是否具有两个基本特性:可遗传性；可识别性（有难度，需要较高的技术）。改善可识别性的思路与方法:提高检测技术的灵敏度（同位素，EB染色、银染等）；加大DNA的绝对量（PCR扩增，大量提取）；上述两者结合使用。DNA分子标记的优点:位点数目相当多，基本上能满足研究之需；直接检测DNA，无需等待基因的表达，也不受环境条件的影响；多为中性突变（因为它一般不属于基因）；多为共显性遗传。常用的DNA分子标记种类:RFLP（限制性片段长度多态性）:利用限制性内切酶对核苷酸序列的识别作用，将基因组DNA切割成不同长度的片段，通过电泳分离、分子杂交及显影技术（同位素或非同位素），把材料间DNA的差异揭示出来。材料间DNA的差异，来自于限制性酶切位点的变异（增加或减少），使切割产物（片段）的长度发生变化（变短或变长），最终产生多态性。技术关键:所用的限制性内切酶能否恰好识别特定的位点（变异位点）。模板酶切前模板酶切后分子杂交及放射性自显影之后出现的多态性RFLP可转化为次级标记,如酶切扩增多态性序列(CAPS)或序列标记位点（STS）,是指将能产生多态性的RFLP探针的两端测序,合成引物对基因组进行扩增,扩增产物为基因组中与探针同源的DNA片段,由于这样的扩增片段一般较少表现多态性,还需要用多种内切酶酶切扩增产物,以期获得扩增片段内存在的多态性。由于只有扩增片段长度内（即探针片段长度内）存在的多态性才有可能被检测到,这种方法所检测的的多态性水平较低。ALP（扩增子长度多态性）RAPD(随机扩增多态性DNA),AP-PCR(随机引物PCR扩增)和DAF(DNA扩增指纹分析)相似,都是以随机引物PCR扩增为基础,它们合称为ALP。RAPD和AP-PCR分别由Williams等（1990）及Welsh等（1990）于1990年提出,被分别用于遗传作图和基因组指纹分析。但两者其实是类似的方法。与一般的PCR扩增相比,RAPD和AP-PCR采用随机设计的单个引物,常用的引物为10个核苷酸的DNA序列,扩增时退火温度降低至35℃左右,以利于引物与模板结合。DAF则是由Caetano-Annoles等人（1991）于1991年建立的,所用的引物更短（5-8个核苷酸）,扩增产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后银染观察,DAF可产生更多的DNA扩增片段,单个反应能获得较多的信息。这三种标记都呈显性遗传。模板DNARAPD电泳谱带引物的结合位点数目多少及其在基因组中的分布情况,是RAPD分析的关键所在。RAPD分析的最佳片段大小为400～2000bp。RAPD标记也可转化为次级标记,称为序列特异性扩增区（SCAR）,是指在RAPD分析中获得多态性DNA片段以后,对其两端测序,根据所测DNA序列,重新设计双引物进行特异PCR扩增,用以提高检测的可靠性和稳定性。SCAR在不同个体之间可能表现为存在／缺失,为显性标记,也可能表现为扩增片段长度的差异,为共显性标记。AFLP(扩增片段长度多态性)AFLP是RFLP和RAPD两项技术的结合，它是荷兰科学家Zabeau和Vos（1993）发明的一种标记技术，已在美国申请了专利。先将DNA用限制性内切酶降解，然后连上一个接头，根据接头和酶切位点的核苷酸序列设计引物，即:引物＝接头＋酶切位点＋2～3个选择性核苷酸，对基因组限制性酶切片段进行选择性PCR扩增。AFLP标记所检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段内DNA序列的插入或缺失，本质上与RFLP技术相同，但操作简单得多。模板DNAAFLP指纹图AFLP分析的最佳片段大小为200～500bp。选择性核苷酸数目一般为3个,能够检测限制性片段总数的1/4076。SSR（简单重复序列）也称微卫星或短串联重复序列多态性（STRP）。它是基因组中二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的简单串联重复,由于重复次数的不同而产生DNA片段长度的多态性。其检测采用PCR扩增。与RFLP相比,微卫星DNA在基因组中非常丰富,分布也比较均匀,多态性水平高,是一种较理想的分子标记,但该类标记的物种特异性强,工作量大,费用高。SSR其它:SNP（单核苷酸多态性）:单核苷酸的变异广泛存在，可通过特别的方法进行检测（测序或荧光法）。SSCP（单链构型多态性）:对RFLP标记设计引物进行PCR扩增，热变性成单链再复性，由于单链内核苷酸顺序的差异，有的可复性为双链，有的则形成链内氢健，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。RAMP(RandomAmplifiedMicrosatellitePolymorphism)。SRAP,STMS,ESTP,CAPS,RGHP,SAMPL,MITES等。二、分子标记的应用品种鉴别用分子标记鉴别果树品种具有十分重要的意义。虽然报道的果树品种数量很多（如葡萄为14000个以上）,但其中可能存在不少同物异名或同名异物情况,需要纠正。利用分子标记鉴别同物异名的情况最为有效,因为它不受环境条件的影响。其次,在众多的果树无性系中,系间尤其是芽变系品种间的差异往往不是十分明显,给品种区分带来困难。通过分子标记辨别就相对容易,因为分子标记的长处,就是能检测遗传物质的细微差异。目前用DNA标记进行品种鉴别或分类研究的果树种有苹果、梨、桃、柑橘、葡萄、草莓、油橄榄、番荔枝、番木瓜、芒果、悬钩子、乌饭树、酸果蔓及桑树等,涉及的分子标记种类也相当齐全。异名品种鉴别芽变品系鉴别遗传多样性检测与品种分类DNA序列的改变,是导致生物演化的最基本的元素,因此,通过DNA分子标记研究,更能揭示个体间的差异及物种间的相关性,这些知识对利用野生种质资源改良栽培品种也十分有用。在果树上,这方面的研究已成为一个热点,涉及的树种非常之多。已证实宽皮柑橘类、果梅和油橄榄品种间具有高度的遗传多样性,而桃和草莓的却比较低。遗传多样性水平的高低直接取决于样本的数量和来源地。利用数字分类学软件,可以很方便地进行聚类分析和分类研究,得到树状图。常用的软件有NTSYS-pc,Popgene（/）和SAS（SASInstituteInc）等,前两者的效果更好。类研究—RAPD分析分类研究—树状图遗传多样性和聚类分析的结果,还能指导杂交亲本的选择选配工作,并可用于预测后代的杂种优势。系谱分析果树存在着大量的自然杂种类型,一些著名的栽培品种,最初也是由自然杂交籽苗繁衍而来,有些品种则是实生选种或采用混合花粉杂交选育而成的,其系谱关系很模糊。DNA分子标记为这一问题的解决提供了有力的工具。有关的研究已证明,柠檬可能起源于枸橼、温州蜜柑应起源于中国的本地早（而非日本立花橘）,苹果上,两个三倍体品种品种“乔纳金”（金冠×红玉）和“陆奥”（金冠×印度）,都是由母本金冠提供了未减数的配子,日本苹果品种“津轻”的父本为“红玉”,新西兰的主栽品种“Braeburn”的亲本为“LadyHamilton”。父本系谱关系的鉴别利用父本的显性标记鉴别父本系谱；利用母本的显性标记或细胞质标记鉴别母本系谱。状图中的系谱关系构建分子遗传图谱可为目标基因的定位及克隆奠定基础（图位克隆）；利用连锁关系,可对目标性状进行预选,预选工作可在幼苗期即完成；利用连锁关系,可进行基因聚合育种,定向地改良品种（不断加强某个经济性状）；对质量性状和数量性状都适用。f

mM04离位点的获得连锁图谱构建连锁群之一目前，应用RAPD.RFLP及同工酶等标记，已构建了苹果、桃、扁桃、柑橘、葡萄、甜樱桃、尖苞片蕉（香蕉的原始种之一，为二倍体）、番木瓜、核桃和越橘（乌饭树）的分子连锁图，而其中单独应用RAPD标记或以RAPD标记为主进行图谱构建的树种就有柑橘、苹果、桃、葡萄、甜樱桃、二倍体蕉、番木瓜和越橘8个种类，所用的作图群体为F1、BC1、F2和花粉培养群体。加上荔枝，共有11种果树。基因标记、定位与辅助选择在许多情况下,果树品种的改良,只需针对个别性状进行,因此,只要找到与目的基因紧密连锁的分子标记,即可用于早期选择。在这方面,Michelmore等（1991）建立的基于RAPD技术的集团分离分析法（BSA）提供了有力的工具,该方法的通常做法是,针对某一性状（如抗病性）,将分离群体的单株分成两个集团（抗病集团和感病集团）,对其进行DNA多态性分析（常用RAPD）,寻找多态性片段。从理论上说,这两个集团的DNA应是基本一样的,如果其间的确存在DNA的差异,那么这种差异（即多态性DNA片段）就很可能与控制该性状（抗病性）的基因座位连锁,可以用于辅助选择。Cheng等在Rome

Beauty

x

White

Angle的分离群体中进行研究,从350个随机引物中选出一个引物

BC226(5’GGGCCTCTAT3’),可在两个池(红色池和黄色池)间扩增出不同的片段。在群体上的进一步试验发现有两个片段与红色性状相关,另外两个片段与黄色性状有关。设计合成一对通用引物来扩增这些片段,不同的扩增片段与果实颜色表现共分离,片段A1(1160

bp)与

Rome

Beauty、A2

(1180

bp)与White

Angle的红色性状连锁,a1

(1230

bp)与黄色性状相连锁。后代同时具有A1和A2或其中之一,则表现红色。在另外的3个杂交组合中,A与红色性状共分离,a1

和a2

(1320

bp)与黄色性状相关。集团分离分析在果树基因定位方面已被广泛应用,目前果树上已标记的基因包括抗性基因、经济性状基因以及QTL基因几个类别。如苹果抗黑星病Vf基因,柑橘抗柑橘衰退病（CTV）基因,苹果抗疫霉病基因,桃抗白粉病基因,葡萄抗黑痘病及抗霜霉病基因等。经济性状方面,已被标记并用于辅助选择的基因座位有苹果果皮颜色,桃的经济性状（8个质量性状）,荔枝的成熟期、焦核性,葡萄的无籽性状、皮色及育性等。杂种、体细胞杂种、突变体、珠心苗与合子苗的鉴定根据父本的特征带可以鉴定其后代是否为真正的杂种,具有多方面的用途。分子标记对体细胞杂种的鉴别也非常有效,在柑橘类上有较多的成功经验。突变体是基因组个别或少数位点发生突变的结果,由于一个引物仅能检测基因组的极小部分,因而突变体的检测比较困难,需采用大量的引物才可能获得成功。突变体的鉴别在樱桃、桃和荔枝上有成功的报道。荔枝焦核突变体的鉴定其它方面,如鉴别苹果品种的芽变植株与实生苗植株,苹果属的显性矮化主基因、元帅系苹果的短枝型芽变,苹果的柱形株型基因,以及柑橘的合子苗与珠心苗等,都有成功的报道。由此看来,分子标记在物种起源与进化,品种分类与杂种鉴定等方面都有广阔