DB32T 2583-2013 饲料中饲用芽孢杆菌的测定

饲料中饲用芽孢杆菌的测定江苏省质量技术监督局发布本标准编写按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定。DB32/T2583-2013GB/T20195动物饲料试样的制备GB/T4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定(原文中的参考文献)25.6pH计(精确到±0.1个单位)或精密pH试纸6.10.85%灭菌生理盐水36.117%氯化钠生长培养基8.1.1以无菌操作称取试样25g(mL),放于含有225mL0.8预置适当数量的玻璃珠),置振荡器上振荡30min,经充分振摇后，制成1:10的均匀稀释液。选择2个-3个适宜的稀释度，水浴80℃4…ΣC——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；nl第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d稀释因子(第一稀释度)。示例：1:100000(第一稀释度)1:1000000(第二稀释度)菌落数(CFU)上述数据按9.2.2数字修约后，表示为25000000或2.5×10²。9.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可9.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计9.1.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。9.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300C9.2芽孢杆菌总数的报告9.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。9.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。9.2.3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。10芽孢杆菌的鉴定(可选择)致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化10.2纯培养自平板上挑取5个菌落，分别划线接种于营养琼脂平板上，36℃±1℃培养箱中培养48h±2h,从每一平板上选取至少一个良好分离的特征菌落10.3形态观察将挑选纯化的菌落做革兰氏染色镜检，饲用芽孢杆菌的菌落特征及染色镜检见表1将挑选纯化的菌落进行二乙酰(V-P)测定、糖发酵、明胶液化、丙酸盐利用和7%氯化钠生长试验。饲用芽孢杆菌的生理生化特征见表2。5菌种枯草芽孢杆菌(B.subulis)圆形或蔓延成波浪形、不规则性，灰白色或微黄色细胞为杆状，有芽孢，芽孢椭圆形，中氏阳性地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)明，扁平，边缘不整齐呈毛发状细胞为杆状，单个、成对或短链排列，阳性凝结芽孢杆菌(B.coagulans)细胞为杆状，单个、成对或短链排列，短小芽孢杆菌(B.pumilus)迟缓芽孢杆菌(B.lentus)细胞为杆状，芽孢椭圆形，中生或近中侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)细胞为杆状，芽孢为椭圆形，侧生、中十十十十十十产酸十十d十十十十d十十十十十d十十水解明胶十十十d十十十十十十十d十十十硝酸盐还原十十dd十十十十十十十十dd十十注：+表示90%以上菌株阳性；—表示90%以上菌株阴性；d表示11%-89%菌株为阳性；N1(规范性附录)蛋白胨牛肉膏氯化钠结晶紫1%草酸铵水溶液碘碘化钾A.2.2.2制法A.2.3.2制法A.2.4染色法2DB32/T258A.2.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗。A.2.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。A.2.4.3滴加95%乙醇脱色，约15s～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.2.4.4滴加复染液，复染1min。水洗、待干、镜检。A.3.1度培养基A.3.1.1成分蛋白胨氯化钠溶解各成分与水中，必要时加热。调整pH使培养基为7.0±0.2,分装试管，115℃高压灭菌30min。A.3.3试验方法取培养液和40%氢氧化钠等量相混。加少许肌酸，10min后如培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。A.4芽孢杆菌糖发酵管A.4.1成分氯化钾酵母膏A.4.2制法除指示剂溴甲酚紫外，其余各成分溶解于水，必要时加热。调整pH使培养基为7.0±0.2,加入指示剂溴甲酚紫，分装试管，115℃高压灭菌30min。A.4.3试验方法挑取小量培养物接种于上述培养基中，37℃±1℃培养2d～5d,观察指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝(紫)为阴性。A.5明胶液化A.5.1成分3蛋白胨牛肉膏明胶蛋白胨牛肉膏酵母浸膏磷酸氢二钾磷酸二氢钾氯化钠丙二酸钠4DB32/T2583-2013A.7.3试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于36℃±1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色；培养基不A.8柠檬酸盐利用氯化钠加热溶解，调整pH至7.0±0.2,加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌20min。A.8.3试脸方法用琼脂培养物接种整个斜面，在36℃±1℃培养7d,每天观察结果。阳性者培养基变为红色，否A.9硝酸盐还原硝酸钾蛋白胨加热溶解，调整pH至7.0±0.2,分装试管，每管约5mL,121℃高压灭菌15min。A.9.2试剂甲液乙液甲萘胺0.1g二苯胺试剂A.9.3