DB22T 3440-2023 人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR和实时荧光PCR法　

22DetectionofClonorchissinensiseggsinhumanfeces-PCRandrealtimePCRI 2 2 2 3 3 3 4 4 5 6 7本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件主要起草人：马文晨、孟庆峰、赵大力、王玮琳、刘金华、孟日增、王伟1人粪便中华支睾吸虫虫卵检测PCR和实时荧光PCR法GB/T6682分析实验室用水规格和试验4缩略语CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithyDNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacidNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyriboEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticaFAM：6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescTE缓冲液：Tris-HCl、EDTA缓冲液（Tris-EMGB：小沟结合物（minorgroovebinder）5.1.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。25.1.10异丙醇。5.1.13加样缓冲液。5.1.14GoldenView核5.1.15PremixTaq反应预混5.1.16PremixExTaq（ProbeqPCR2×)反应预混液（市售商品化荧光PCR基础试剂）。5.1.17琼脂糖凝胶。5.3.1无DNA酶污染的离心5’-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3’5’-ACTATCCCAGTAACCCCGCC-3’5’-TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3’5’-AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3’5’-FAM-AGCTCATCATATGTTTACTG-MGB-3’36.6离心机(离心力不小于12000g)。6.11天平(感量0.01g)。蛋白酶K溶液，65℃孵育30min,期间每隔10min振荡混匀；12000g离心10min,转移上8.4加2倍体积CTAB沉淀液(0.5%),室温静止60min,12000g离心15min,弃上清。4N——核酸稀释倍数。作阳性对照，用不含目标基因的核酸做阴性对照，用水做空用量(μL）（含PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Tap酶）分子量作对照，使用100bpDNA分子量标准。5V/cm恒压电泳3卵核酸阴性，表述为“未检出华支睾吸虫虫卵核酸”；如被检样品有条带，大小为231bp，即判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性，表述为“检出华支睾吸虫虫10.1.4.2必要时取PCR扩增产物进行序列测定，测序结果与附录B华支睾吸虫虫卵的D5作阳性对照，用不含目标基因的核酸做阴性对照，用水做空用量(μL）PremixExTaq（ProbeqPCR2×)（含PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Ta），线，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性，否则判定为华支睾吸虫虫卵6试剂配制A.6蛋白酶K溶液（20mg/mL称量A.7NaCl溶液（1.2mol/L称取8kPa蒸汽压（121℃)条件下灭菌20min，室温保存。A.11加样缓冲液：称取0.88gNa2EDTA•7B.1PCR扩增产物序列（231bp，GenBankNo.：OM81033TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTTAGCTCGGTATGATTATAGGTGTGCCTACAGGGATCAAGGTTT